不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

白尚星

【摘要】目的观察不同培养基对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)生物学特性的影响, 优化培养方法。方法采用贴壁法从正常足月胎儿脐带中分离出间充质干细胞, 细胞贴壁后利用DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium这两种培养体系进行体外扩增, 绘制生长曲线, 流式细胞仪检测其表面标志。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形, 呈平行排列生长或漩涡状生长；细胞表达CD29、CD44, 不表达CD34、CD45和HLA-DR。结论加入Mesen PRORSTM Medium培养的细胞增殖速度快, 更适合于脐带间充质干细胞的体外扩增。

【关键词】间充质干细胞；脐带；生物学特性

Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cellBAI Shang-xing.Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China

【Abstract】Objective To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods. Methods Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method. These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTM Medium in vitro. The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry. Results Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability. The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point. They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR. Conclusion Cell doubling time in the Mesen PRORSTM Medium was shorter than in DMEM/F12.

【Key words】Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)来源于发育早期的中胚层, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞［1, 2］, 广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中［3］。脐带为分娩废弃物, MSC含量丰富, 无需有创穿刺即可获得, 且较骨髓来源的MSC扩增能力更强, 成为近年来MSC研究的重要来源之一［4］。本研究采用两种不同培养基培养hUC-MSCs, 并对其进行生物学特性的观察、细胞免疫表型的鉴定, 以期建立一种稳定、高效、快速、经济的hUC-MSCs富集方法, 为临床细胞移植提供实验支持。

1材料

1. 1脐带选择足月胎儿的脐带, 产妇身体健康, 肝功能正常, 无传染性疾病, 签署知情同意书。脐带4℃无菌保存, 4 h内完成实验操作。

1. 2主要试剂DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium和胰蛋白酶购自GibCO；胎牛血清(FBS)购自HyClone；鼠抗人抗体CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC购自BD。

2方法

2. 1人脐带MSCs 的分离、培养及扩增 脐带剪成3~5 cm小段取出脐带放入培养皿中, 用0.9%氯化钠注射液冲洗, 洗尽血液。用手术剪剔除血管和外膜, 剪成2~3 mm小块, 用0.9%氯化钠注射液清洗一次, 用DMEM/F12培养基清洗一次, 分成两组：A组加入培养基(含50%Mesen PRORSTM Medium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B组加入培养基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培养瓶中, 组织块密度要适中, 每瓶20 ml, 放置于37℃, 体积分数5%CO2, 饱和湿度培养箱内培养。倒置显微镜下观察, 有少量成纤维状细胞贴壁生长, 倒掉培养基和组织块。添加培养基继续培养, 每3天换液, 细胞生长达80%以上时, 用胰酶消化, 按1：3传代。

2. 2细胞生长曲线制作取生长良好的3代细胞, 按2×104/ml浓度接种24孔板, 每孔1 ml, 3 d换液一次, 以第2 d起每隔24小时计数3个孔细胞数, 取其平均值, 绘制7 d的生长曲线。

2. 3hUC-MSCs表面标记的检测取3代细胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗涤2次, 制成l×106的细胞悬液, 每管加入100 μl, 设置阴性对照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室温避光孵育30 min, 流式细胞仪计数5000~10000个细胞。

3结果

3. 1hUC-MSCs的分离、培养和纯化两组培养基原代脐带间充质干细胞接种6~7 d, 除去组织块, 倒置显微镜下可见有少量纤维状的贴壁细胞, 2 d后形成散在的细胞集落, 大部分是长梭形的成纤维样细胞, 细胞折光性好, 14~18 d细胞集落增多, 细胞融合80%以上。(见图lA-B)用0.25%胰酶消化传代, 3代后可得到较为纯化的间充质干细胞, 传代后的细胞增殖速度快, 约3~4 d可传代1次。传代后细胞形态较原代均一, 以平行排列生长或漩涡状生长。两组培养基培养的间充质细胞形态相似, 无明显差别。A组贴壁细胞较多, 细胞生长较快。

图1人脐带MSCs ( 倒置显微镜下) 的形态特征

3. 2hUC-MSCs生长曲线 传代后的细胞第1~2天处于滞留期, 无明显增殖。第3~5天进入对数生长期, 细胞增殖加速达到高峰, 第6~7天进入平台期, A组细胞增殖快于B组细胞(见图2)。

图2人脐带MSCs 的生长曲线

3. 3hUC-MSCs的表面标志流式细胞仪检测结果表明, hUC-MSCs不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR, 表明本实验分离的细胞符合间充质干细胞的表面标志；两组培养基抗原表达无显著差异。见表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

组别 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A组 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B组 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4讨论

间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中, 其中尤以脐带间充质干细胞更为原始, 分化能力和增殖能力强, 且其来源于胚胎组织, 免疫原性更低［5］。脐带中有2条动脉和1条静脉, 包绕动静脉的黏蛋白样结缔组织即为华通氏胶(Warthons jelly)。目前可从脐带静脉内皮、内皮下层、Warthons jelly、血管周围组织以及羊膜来源的上皮组织等中分离得到MSCs ［6］。脐带来源广泛, 采集方便, 免疫排斥小, 伦理争议小等优点, 使其成为干细胞研究热点, 在细胞治疗中前景越来越广阔。本实验成功从人脐带中分离出间充质干细胞, 获得的原代细胞能够连续传代, 传代后细胞纯度提高, 形态较原代均一, 以平行排列生长为主, 或呈漩涡状生长, 细胞能够大量增殖, 经流式细胞仪检测, hUC-MSCs不表达造血细胞标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR说明其免疫原性极低, 符合间充质干细胞的特点。用于脐带间充质干细胞体外培养的体系包括低糖DMEM、DMEM/F12和无血清培养体系。其中DMEM/F12是由DMEM培养基和F12培养基按1：1混合组成的, 其营养成分丰富, 可以使用较少血清, 或作为无血清培养基的基础培养基, 适于原代细胞培养［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一种无血清培养基, 适合于间充质干细胞的培养, 但其价格昂贵, 不利于大量使用。本实验在DMEM/F12培养基基础上加入适量的Mesen PRORSTM Medium培养细胞, 结果表明, 能够大量增殖细胞并且缩短培养时间, 还可以减少血清的用量, 减少移植输注给患者时产生的不良反应。因此, 无论从培养角度, 还是从临床应用考虑, 培养细胞时适量加入Mesen PRORSTM Medium都是较好的培养方式。

参考文献

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 张茜真, 韩俊领, 等.人脐带间充质干细胞在3 种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效定.中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黄益民, 等.人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

图2人脐带MSCs 的生长曲线

3. 3hUC-MSCs的表面标志流式细胞仪检测结果表明, hUC-MSCs不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR, 表明本实验分离的细胞符合间充质干细胞的表面标志；两组培养基抗原表达无显著差异。见表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

组别 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A组 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B组 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4讨论

间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中, 其中尤以脐带间充质干细胞更为原始, 分化能力和增殖能力强, 且其来源于胚胎组织, 免疫原性更低［5］。脐带中有2条动脉和1条静脉, 包绕动静脉的黏蛋白样结缔组织即为华通氏胶(Warthons jelly)。目前可从脐带静脉内皮、内皮下层、Warthons jelly、血管周围组织以及羊膜来源的上皮组织等中分离得到MSCs ［6］。脐带来源广泛, 采集方便, 免疫排斥小, 伦理争议小等优点, 使其成为干细胞研究热点, 在细胞治疗中前景越来越广阔。本实验成功从人脐带中分离出间充质干细胞, 获得的原代细胞能够连续传代, 传代后细胞纯度提高, 形态较原代均一, 以平行排列生长为主, 或呈漩涡状生长, 细胞能够大量增殖, 经流式细胞仪检测, hUC-MSCs不表达造血细胞标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR说明其免疫原性极低, 符合间充质干细胞的特点。用于脐带间充质干细胞体外培养的体系包括低糖DMEM、DMEM/F12和无血清培养体系。其中DMEM/F12是由DMEM培养基和F12培养基按1：1混合组成的, 其营养成分丰富, 可以使用较少血清, 或作为无血清培养基的基础培养基, 适于原代细胞培养［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一种无血清培养基, 适合于间充质干细胞的培养, 但其价格昂贵, 不利于大量使用。本实验在DMEM/F12培养基基础上加入适量的Mesen PRORSTM Medium培养细胞, 结果表明, 能够大量增殖细胞并且缩短培养时间, 还可以减少血清的用量, 减少移植输注给患者时产生的不良反应。因此, 无论从培养角度, 还是从临床应用考虑, 培养细胞时适量加入Mesen PRORSTM Medium都是较好的培养方式。

参考文献

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 张茜真, 韩俊领, 等.人脐带间充质干细胞在3 种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效定.中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黄益民, 等.人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］

图2人脐带MSCs 的生长曲线

3. 3hUC-MSCs的表面标志流式细胞仪检测结果表明, hUC-MSCs不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR, 表明本实验分离的细胞符合间充质干细胞的表面标志；两组培养基抗原表达无显著差异。见表1。

表1hUC-MSCs的表面抗原(%)

组别 CD29 CD44 CD45 CD34 HLA-DR

A组 0.98 0.94 0.04 0.15 0.31

B组 0.95 0.93 0.03 0.18 0.29

4讨论

间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中, 其中尤以脐带间充质干细胞更为原始, 分化能力和增殖能力强, 且其来源于胚胎组织, 免疫原性更低［5］。脐带中有2条动脉和1条静脉, 包绕动静脉的黏蛋白样结缔组织即为华通氏胶(Warthons jelly)。目前可从脐带静脉内皮、内皮下层、Warthons jelly、血管周围组织以及羊膜来源的上皮组织等中分离得到MSCs ［6］。脐带来源广泛, 采集方便, 免疫排斥小, 伦理争议小等优点, 使其成为干细胞研究热点, 在细胞治疗中前景越来越广阔。本实验成功从人脐带中分离出间充质干细胞, 获得的原代细胞能够连续传代, 传代后细胞纯度提高, 形态较原代均一, 以平行排列生长为主, 或呈漩涡状生长, 细胞能够大量增殖, 经流式细胞仪检测, hUC-MSCs不表达造血细胞标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR说明其免疫原性极低, 符合间充质干细胞的特点。用于脐带间充质干细胞体外培养的体系包括低糖DMEM、DMEM/F12和无血清培养体系。其中DMEM/F12是由DMEM培养基和F12培养基按1：1混合组成的, 其营养成分丰富, 可以使用较少血清, 或作为无血清培养基的基础培养基, 适于原代细胞培养［7, 8］。Mesen PRORSTM Medium是一种无血清培养基, 适合于间充质干细胞的培养, 但其价格昂贵, 不利于大量使用。本实验在DMEM/F12培养基基础上加入适量的Mesen PRORSTM Medium培养细胞, 结果表明, 能够大量增殖细胞并且缩短培养时间, 还可以减少血清的用量, 减少移植输注给患者时产生的不良反应。因此, 无论从培养角度, 还是从临床应用考虑, 培养细胞时适量加入Mesen PRORSTM Medium都是较好的培养方式。

参考文献

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al. Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells. Curr Opin Hematol, 2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H. In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels. J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al. Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas. PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY. The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R. Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 张茜真, 韩俊领, 等.人脐带间充质干细胞在3 种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效定.中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黄益民, 等.人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(10): 1087-1093.

［收稿日期：2014-03-10］