不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

白尚星

不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

白尚星

目的 观察不同培养基对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)生物学特性的影响, 优化培养方法。方法 采用贴壁法从正常足月胎儿脐带中分离出间充质干细胞, 细胞贴壁后利用DMEM/F12, Mesen PRORSTMMedium这两种培养体系进行体外扩增, 绘制生长曲线, 流式细胞仪检测其表面标志。结果 从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形, 呈平行排列生长或漩涡状生长；细胞表达CD29、CD44, 不表达CD34、CD45和HLA-DR。结论 加入Mesen PRORSTMMedium培养的细胞增殖速度快,更适合于脐带间充质干细胞的体外扩增。

间充质干细胞；脐带；生物学特性

间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)来源于发育早期的中胚层, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞［1,2］, 广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中［3］。脐带为分娩废弃物, MSC含量丰富, 无需有创穿刺即可获得, 且较骨髓来源的MSC扩增能力更强, 成为近年来MSC研究的重要来源之一［4］。本研究采用两种不同培养基培养hUC-MSCs, 并对其进行生物学特性的观察、细胞免疫表型的鉴定, 以期建立一种稳定、高效、快速、经济的hUC-MSCs富集方法, 为临床细胞移植提供实验支持。

1 材料

1.1 脐带 选择足月胎儿的脐带, 产妇身体健康, 肝功能正常, 无传染性疾病, 签署知情同意书。脐带4℃无菌保存, 4 h内完成实验操作。

1.2 主要试剂 DMEM/F12, Mesen PRORSTMMedium和胰蛋白酶购自GibCO；胎牛血清(FBS)购自HyClone；鼠抗人抗体CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLADR-FITC购自BD。

2 方法

2.1 人脐带MSCs 的分离、培养及扩增 脐带剪成3～5 cm小段取出脐带放入培养皿中, 用0.9%氯化钠注射液冲洗, 洗尽血液。用手术剪剔除血管和外膜, 剪成2～3 mm小块, 用0.9%氯化钠注射液清洗一次, 用DMEM/F12培养基清洗一次,分成两组：A组加入培养基(含50%Mesen PRORSTMMedium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B组加入培养基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培养瓶中, 组织块密度要适中,每瓶20 ml, 放置于37℃, 体积分数5%CO2, 饱和湿度培养箱内培养。倒置显微镜下观察, 有少量成纤维状细胞贴壁生长,倒掉培养基和组织块。添加培养基继续培养, 每3天换液,细胞生长达80%以上时, 用胰酶消化, 按1：3传代。

2.2 细胞生长曲线制作 取生长良好的3代细胞, 按2×104/ml浓度接种24孔板, 每孔1 ml, 3 d换液一次, 以第2 d起每隔24小时计数3个孔细胞数, 取其平均值, 绘制7 d的生长曲线。

2.3 hUC-MSCs表面标记的检测 取3代细胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗涤2次, 制成l×106的细胞悬液, 每管加入100 μl, 设置阴性对照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室温避光孵育30 min, 流式细胞仪计数5000～10000个细胞。

3 结果

3.1 hUC-MSCs的分离、培养和纯化 两组培养基原代脐带间充质干细胞接种6～7 d, 除去组织块, 倒置显微镜下可见有少量纤维状的贴壁细胞, 2 d后形成散在的细胞集落, 大部分是长梭形的成纤维样细胞, 细胞折光性好, 14～18 d细胞集落增多, 细胞融合80%以上。(见图lA-B)用0.25%胰酶消化传代, 3代后可得到较为纯化的间充质干细胞, 传代后的细胞增殖速度快, 约3～4 d可传代1次。传代后细胞形态较原代均一, 以平行排列生长或漩涡状生长。两组培养基培养的间充质细胞形态相似, 无明显差别。A组贴壁细胞较多,细胞生长较快。

3.2 hUC-MSCs生长曲线 传代后的细胞第1～2天处于滞留期, 无明显增殖。第3～5天进入对数生长期, 细胞增殖加速达到高峰, 第6～7天进入平台期, A组细胞增殖快于B组细胞(见图2)。

3.3 hUC-MSCs的表面标志 流式细胞仪检测结果表明, hUC-MSCs不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR, 表明本实验分离的细胞符合间充质干细胞的表面标志；两组培养基抗原表达无显著差异。见表1。

组别CD29CD44CD45CD34HLA-DR A组0.980.940.040.150.31 B组0.950.930.030.180.29

4 讨论

间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中, 其中尤以脐带间充质干细胞更为原始, 分化能力和增殖能力强, 且其来源于胚胎组织, 免疫原性更低［5］。脐带中有2条动脉和1条静脉, 包绕动静脉的黏蛋白样结缔组织即为华通氏胶(Warthon’s jelly)。目前可从脐带静脉内皮、内皮下层、Warthon’s jelly、血管周围组织以及羊膜来源的上皮组织等中分离得到MSCs［6］。脐带来源广泛, 采集方便,免疫排斥小, 伦理争议小等优点, 使其成为干细胞研究热点,在细胞治疗中前景越来越广阔。本实验成功从人脐带中分离出间充质干细胞, 获得的原代细胞能够连续传代, 传代后细胞纯度提高, 形态较原代均一, 以平行排列生长为主, 或呈漩涡状生长, 细胞能够大量增殖, 经流式细胞仪检测, hUCMSCs不表达造血细胞标志CD34、CD45, 强表达CD29和CD44, 不表达HLA-DR说明其免疫原性极低, 符合间充质干细胞的特点。用于脐带间充质干细胞体外培养的体系包括低糖DMEM、DMEM/F12和无血清培养体系。其中DMEM/F12是由DMEM培养基和F12培养基按1：1混合组成的, 其营养成分丰富, 可以使用较少血清, 或作为无血清培养基的基础培养基, 适于原代细胞培养［7,8］。Mesen PRORSTMMedium是一种无血清培养基, 适合于间充质干细胞的培养, 但其价格昂贵, 不利于大量使用。本实验在DMEM/F12培养基基础上加入适量的Mesen PRORSTMMedium培养细胞, 结果表明, 能够大量增殖细胞并且缩短培养时间, 还可以减少血清的用量, 减少移植输注给患者时产生的不良反应。因此, 无论从培养角度, 还是从临床应用考虑, 培养细胞时适量加入Mesen PRORSTMMedium都是较好的培养方式。

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Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cell

BAI Shang-xing. Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China

Objective To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods.Methods Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method.These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTMMedium in vitro.The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry.Results Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability.The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point.They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR.Conclusion Cell doubling time in the Mesen PRORSTMMedium was shorter than in DMEM/F12.

Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics

2014-03-10］

110000 沈阳市第六人民医院