肝素诱导性血小板减少症的研究进展

郑永威，袁榴娣

(东南大学 生命科学研究院，江苏 南京 210009)

1 血小板因子4/肝素复合物

HIT是一类免疫性疾病，而血小板因子4(platelet factor 4，PF4)/肝素复合物则是此类血小板减少症的主要诱发因素[6]。肝素属于糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)的一种，分子质量从3～30 kDa不等，由多个重复的硫酸化双糖所组成。在已知的生物分子中，肝素所带的负电荷密度最高[7]，以此能与不同的正电荷离子形成盐复合物。PF4是一类富含赖氨酸的四聚体蛋白，属于趋化因子CXC超级家族的一员，又称CXCL4。在正常的生理状态下存储于血小板α颗粒中，当血小板受到刺激而激活便会随之释放进血液当中[8]。

作为带负电的长链多糖分子，肝素能与血液中带正电的PF4结合形成具有抗原性的多分子复合物，从而激活免疫系统产生PF4/肝素特异性的抗体[9]。

2 HIT的发病机制

正常生理状态下，血液中的PF4与血小板或血管内皮细胞表面的内源性糖胺聚糖所结合[8]。当病人接受完创伤性较大的手术后，血小板被激活并释放血小板颗粒内含物，使得血液中PF4浓度升高。作为抗凝血剂而使用的肝素进入血液后，通过异性电荷间的相互作用而与PF4形成具有抗原性的多分子复合物。复合物的形成使得分子的结构发生改变，此时免疫系统中的B细胞将此类复合物视作外源分子，并随之产生PF4/肝素复合物特异性的免疫球蛋白。后者通过抗体Fab片段特异性地与PF4/肝素复合物结合，进而形成由抗体/PF4/肝素所组成的超级抗原性复合物[10]。人类血小板表面表达FcγRⅡa受体，是一类激活性的Fcγ受体，能特异性地与免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段结合。抗体/PF4/肝素超级抗原性复合物通过抗体上的Fc片段与血小板上的FcγRⅡa受体结合[11]，由于复合物上有多个抗体Fc片段与FcγRⅡa受体结合并形成交联反应，进而使得血小板被激活。一方面，由于抗体免疫复合物的结合，激活了由抗体Fc片段介导的巨噬细胞的吞噬作用，使得结合了免疫复合物的血小板被巨噬细胞所清除，从而引起血液中血小板数目的减少[10]。另一方面，活化的血小板释放更多促凝血因子，促使血小板凝集并形成动脉或静脉血栓[12]。

3 HIT的免疫学特性

在免疫系统中，抗体是由B淋巴细胞所产生。而在HIT中，抗原复合物特异性抗体是疾病发生的关键因素，考虑到HIT在免疫学上具有的非典型特征，进一步阐明B细胞在HIT发病机制中的作用显得尤为重要。

4 B细胞在HIT中的作用

2009年，Suvarna等[23]报道了小鼠的HIT免疫模型。通过后眼窝静脉注射，将在体外形成的PF4/肝素复合物注射进C57BL/6野生型小鼠体内，能诱导小鼠产生PF4/肝素复合物特异性的抗体[23]。由于小鼠缺少编码FcγRⅡa受体的基因，因此此小鼠模型的血小板并不减少，且不引起血栓的形成。

Zheng等[13]通过此HIT的小鼠免疫模型，证明了小鼠MZ B细胞在HIT特异性抗体的产生过程中起到关键作用。由于Notch2分子对MZ B细胞的发育及分化起到关键性作用，在B细胞特异性敲除Notch2基因的小鼠体内，MZ B细胞的数量相对于对照组小鼠减少90%，但并不影响FO B细胞和B1 B细胞，以及其他的免疫细胞的数量[24]。通过对此基因敲除小鼠进行PF4/肝素复合物免疫，Zheng等[13]发现，在缺少MZ B细胞的小鼠血清中含有的PF4/肝素复合物特异性抗体明显少于对照组小鼠。此外通过过继性转移(adoptive transfer)实验，将流式分选纯化的野生型小鼠MZ B细胞或FO B细胞分别转移到B细胞缺陷型μMT小鼠体内，并进行PF4/肝素复合物免疫，仅仅只有转移了MZ B细胞的μMT小鼠体内产生了PF4/肝素复合物特异性抗体[13]。综合以上实验表明，小鼠MZ B细胞在PF4/肝素复合物特异性抗体的合成中起着关键性作用。

5 免疫耐受与HIT的关系

在HIT的发病机制中，关键的诱发因子PF4和肝素均为机体自身所存在的成分。PF4存在于血小板α颗粒中，并随着血小板的激活而释放到血液当中[8]。肝素存储于肥大细胞的分泌性颗粒中，在组织受损时释放[7]。在正常的生理状态下，除了肝素以外的内源性糖胺聚糖广泛地表达于内皮细胞表面并能与PF4形成复合物[8，31]。此外带负电的大分子如DNA、RNA同样能与PF4结合形成类似于PF4/肝素的复合物[32]。因此在正常的生理状态下，此类具有免疫原性的PF4复合物是存在的。此时，免疫系统能通过免疫耐受建立起对此类自身抗原的耐受性，从而防止自身性抗体的产生。与此观点一致的是，仅有3%的病人接受了肝素治疗后产生HIT抗体[1]。因此正常人体内很大可能已存在识别PF4/肝素复合物的特异性B细胞，而此类B细胞正处于免疫无应答的状态之下。而后由于手术等的外界因素所引起的炎症反应，在一定程度上使得此类B细胞从免疫无应答转变成免疫应答的状态从而产生抗原特异性抗体。

Zheng等[33]通过实验证实了此类处于免疫无应答状态的PF4/肝素复合物特异性B细胞的存在。他们将从健康供血者血液中纯化出的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)进行体外培养，在CpG等因子的刺激下，体外培养的PBMC产生了识别PF4/肝素复合物的特异性抗体。CpG是Toll样受体9(Toll-like receptor 9)的配体，能模拟细菌感染引起炎症反应，从而激活正常人PBMC中处于免疫无能状态下的B细胞。通过类似的体外细胞培养实验，同样证实了此类B细胞存在于野生型小鼠体内。此外，将CpG直接注射入野生型小鼠体内，能诱导小鼠产生识别PF4/肝素复合物的特异性抗体。

综合以上实验表明，正常人以及野生型小鼠体内存在识别PF4/肝素复合物的特异性B细胞，而此类B细胞在免疫耐受机制的诱导下处于免疫无应答状态。由创伤性手术等外界因素所引起的炎症反应打破了此类B细胞的无应答状态，从而产生识别PF4/肝素复合物的特异性抗体，引起HIT的发生。

6 细菌感染与HIT的关系

由于细菌表面含有多种带负电的多糖分子，Krauel等[37]提出假设，当机体受到细菌感染时，血液中带正电荷的PF4能与细菌表面带负电的多糖分子结合并诱导机体的免疫应答。他们通过实验证实PF4能与革兰阳性细菌或革兰阴性细菌结合，并且被PF4所包被的细菌能够被PF4/肝素复合物特异性抗体所识别。为了进一步验证细菌感染能诱导机体产生PF4/肝素复合物特异性抗体，Krauel等[37]在小鼠升结肠处植入空心支架使得结肠内容物能通过支架进入腹腔从而诱发多细菌性败血症(polymicrobial sepsis)，术后1周小鼠血清中能检出特异性识别PF4/肝素复合物的抗体；此外他们还发现若将PF4/肝素复合物特异性抗体与巨噬细胞以及由PF4包被的大肠杆菌共同孵育时，PF4/肝素复合物特异性抗体的存在能显著地增强巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力。

7 小 结

肝素作为一种抗凝血剂普遍应用于临床，由此所引起的血小板减少症也日趋增多。由于HIT病人出现动脉/静脉血栓的几率相对较高，因此对HIT发病机制的深入研究将有助于对HIT的预防及治疗。作为一类由药物引起的免疫性疾病，B细胞在整个HIT发病过程中起着关键作用。研究表明在小鼠体内，HIT特异性抗体由MZ B细胞产生。然而在人体内，由于取样困难，目前尚无文献报道证实这一观点，因此人MZ B细胞是否参与HIT特异性抗体的合成有待进一步研究。由于PF4与肝素均为机体的自身成分，免疫系统之所以能产生针对PF4/肝素复合物的特异性抗体是与机体的自身免疫耐受有着密切关系。当体内调控自身免疫耐受的机制受阻时，机体产生此类特异性抗体的几率将大为增加。此外，当机体受到细菌感染时，带正电荷的PF4能与带负电的细菌表面成分所结合并诱导机体产生特异性抗体将细菌清除。由于此类用于抵抗细菌感染的特异性抗体具有交叉反应性，因此当引入外源性肝素后，此类抗体能错误地识别PF4与肝素所形成的复合物，从而加大了HIT发病的几率。

HIT作为一种免疫紊乱性疾病，临床上表现出非典型的免疫学特征，既表现出T细胞非依赖性免疫反应的特点，同时又具有T细胞依赖性免疫反应的特征，因此需要实验进一步验证在HIT发病过程中T细胞是否参与。HIT是一种由药物引起的血小板减少症，因此对HIT的深入解析，亦将有助于阐明由其他药物所引起的同类型病症。