脑缺血损伤中Notch信号通路活性的非配体依赖性改变及其作用

莽 靖 王姣琦 刘洪雨 李宗树 杨 乐 胥桂华 何金婷 徐忠信

(吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130033)

经典的Notch信号通路中，位于胞膜的Notch受体需要与邻近细胞的配体结合，进而启动下游信号〔1〕。前期在单细胞系的体外研究中发现脑缺血损伤可诱导Notch1受体高表达〔2〕，而在非配体依赖的条件下，此种受体上调可否激活下游信号及其作用尚不明确。本研究应用体外脑缺血损伤模型，观察Notch1信号的非配体依赖性活性变化及其对神经元样PC12细胞氧糖剥夺(OGD)损伤的影响，进一步探讨该通路参与脑缺血损伤的机制。

1 材料与方法

1.1实验分组 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞，按5×105～10×105/ml密度接种于6孔板，根据之前研究的方法建立神经元样PC12细胞的OGD 12 h模型〔3〕，根据干预手段不同，分为对照组、Notch1-siRNA转染组、OGD组、OGD+Notch1-siRNA转染组，各组设3个平行对照孔，重复实验3次。

1.2主要试剂及仪器 PC12细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司，兔抗大鼠Notch1抗体(中杉金桥，北京)，兔抗大鼠Notch1胞内段(NICD)抗体(叶舟生物，上海)，山羊抗兔IgG-HRP (碧云天，上海)，LipofecamineTM2000(Invitrogen，USA)，UNIQ-10 柱式Trizol 总RNA 提取试剂盒(Sangon，China)，Quantscript cDNA第一链合成试剂盒和RealMasterMix SYBR Green 试剂盒(TIANGEN，China)，荧光定量PCR仪(AB 7500 fast，USA)，流式细胞仪(Beckman-Epics-XL，USA)。

1.3siRNA -Notch1靶点的选择、设计及合成 在Genebank数据库中检索大鼠Notch1基因序列NM001105721，针对其编码区设计3个干扰序列及1个阴性对照序(沈阳万类生物有限公司合成)沉默效果检测后筛选出最佳序列行基因沉默。靶点序列：5′:CCCUGUCACUAUGGUUUGUTT3′;干扰序列：3′ACAAACCAUAUGGACAGGGTT5′。

1.4引物设计 根据之前研究的方法进行Notch1引物设计〔2〕。

1.5细胞转染 转染前1 d将细胞接种至6孔板，24 h后行转染，细胞密度约80%；饥饿处理1 h，转染5 h后弃上清；更换含10%胎牛血清DMEM培养液48 h。

1.6实时荧光定量PCR及Western印迹检测 根据之前研究的方法行实时荧光定量PCR及Western印迹检测〔2〕。

1.7流式细胞术细胞凋亡率检测 将细胞用0.25%胰酶消化后收集细胞，PBS 洗涤3次，加入结合液195 μl悬浮液及5 μl FITC-Annexin V，在室温下避光孵育30 min；PBS 洗涤1次后重新悬浮细胞，加入5 μl碘化丙啶(PI)，在室温避光孵育15 min，行FCM检测。

1.8统计学分析 应用SPSS11.0软件行单因素方差分析和Studentt检验。

2 结 果

2.1OGD 12 h神经元样PC12细胞Notch1受体mRNA表达及siRNA对其影响 与正常对照组(1.02±0.01)比较，Notch1-siRNA组Notch1 mRNA表达(0.34±0.02)显著降低(P<0.05)，OGD组Notch1 mRNA表达(1.23±0.04)较正常对照组显著升高(P<0.05)；OGD+Notch1-siRNA转染组Notch1 mRNA(0.39±0.04)较OGD组显著降低(P<0.05)。

2.2OGD 12 h神经元样PC12细胞Notch1及NICD蛋白表达检测及siRNA对其影响 OGD组Notch1及NICD蛋白表达较正常对照组均显著升高(P<0.05)；OGD+Notch1-siRNA转染组较OGD组显著降低(P<0.05)。见图1和表1。

表1 各组Nothc1及NICD蛋白表达相对定量

2.3OGD 12 h神经元样PC12细胞凋亡率检测及siRNA对其影响 与正常对照组(25.09%±1.22%)比较，OGD组细胞凋亡率(40.57%±0.80%)显著升高(P<0.05)；与OGD组比较，OGD+Notch1-siRNA组细胞凋亡率(56.61%±1.50%)进一步升高(P<0.05)，与正常对照组比较，Notch1 siRNA组细胞凋亡率(29.48%±0.84%)略升高，无明显差异(P>0.05)。见图2。

图1 Western印迹检测Notch1及NICD蛋白表达

A: 正常对照组，B:Notch1-siRN A组，C:OGD组，D:OGD+ Notch1-siRN B组

3 讨 论

Notch 信号通路广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物，在进化过程中高度保守，能通过细胞间相互作用调节细胞分化、增殖和凋亡，此信号通路在多种器官和组织中广泛表达〔4〕。课题组在前期工作中对该通路参与缺血性脑损伤机制进行了初步研究，发现OGD损伤可诱导神经细胞Notch1受体表达上调，给予外源性配体Jagged1可加重其缺血缺氧性损伤〔2〕。前期研究结果虽然提示了Notch1信号通路可能参与缺血性脑损伤，但此种外源性的干预手段与体内的真实环境差别较大。

在经典的Notch1信号通路的激活过程中，Notch1受体的配体多存在于邻近细胞表面，二者特异性结合后可催化Notch1受体的跨膜区发生蛋白裂解，NICD从细胞膜内侧释放，直接进入细胞核发挥生物学作用。Notch配体与受体结合是Notch信号转导通路激活的必要条件，而NICD作为Notch蛋白的活化形式，其表达量则直接反映Notch信号通路的活化状态〔1,5〕。

本研究结果一方面提示了OGD损伤可诱导Notch1信号通路激活，另一方面此种信号通路的激活是不需要依赖外源性配体的。近年来，这种受体在无特异性配体存在时，也可被选择性激活现象正日益受到关注〔6〕，而在缺血性脑损伤中，Notch信号通路的这种非配体依赖的激活现象尚未见报道。Notch1受体作为镶嵌在细胞膜上的一种结构蛋白，其饱和性、亲和性可能受到细胞外环境的影响〔7〕，而本研究结果提示OGD损伤可能不止影响细胞膜的通透性和流动性，可能对Notch1受体的活性及亲和力也发生了影响。而此种非配体依赖性的受体活化更为微观的机制，有待于对OGD状态下受体蛋白质在细胞膜脂质双分子层中的空间构型研究。

本文结果提示OGD损伤诱导的内源性非配体依赖性Notch1通路激活，可能在脑缺血损伤过程中通过抗凋亡而发生神经保护作用。而此种由OGD诱导非配体依赖性信号通路激活机制是Notch1信号通路特有的，还是有可能普遍存在于其他信号系统则需要深入研究。在缺血性脑损伤这一动态变化的病理及病理生理过程中，Notch1信号通路在缺血不同时程可能发挥不同作用，其具体作用则需要对该通路在OGD不同时程进行动态研究。

4 参考文献

1Schroeter EH, Kisslinger JA, Kopan R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain〔J〕. Nature, 1998; 393(6683):382-6.

2郭 娜,何金婷,胥桂华,等. Notch1受体在脑缺血损伤中表达变化及作用的体外研究〔J〕. 中风与神经疾病杂志, 2013;30(4):345-7.

3Chunli M, Jing M, Zhongxin X,etal. NGF combined with OGD induces neural ischemia tolerance in PC12 cells〔J〕. African J Biochem Res, 2011; 5(9):315-20.

4Greenwald I. Notch and the awesome power of genetics〔J〕. Genetics, 2012; 191(3):655-69.

5Nakazawa M, Ishii H, Aono H,etal. Role of Notch-1 intracellular domain in activation of rheumatoid synoviocytes〔J〕. Arthritis Rheum,2001; 44(7):1545-54.

6Deuel TF. Anaplastic lymphoma kinase: “Ligand Independent Activation” mediated by the PTN/RPTP signaling pathway〔J〕. Biochim Biophys Acta, 2013; 1834(10):2219-23.

7Dziewulska D, Rafaowska J. Role of endoglin and transforming growth factor-beta in progressive white matter damage after an ischemic stroke〔J〕. Neuropathology, 2006; 26(4):298-306.