N-乙酰半胱氨酸对人离体嗜中性粒细胞细胞内活性氧和TLR4表达的影响

王春雷 吕 飞 张 烨

(中国医科大学附属第一医院老年内科，辽宁 沈阳 110001)

目前对特发性肺间质纤维化(IPF)的治疗尚无确实、有效的方法，主要药物糖皮质激素、免疫抑制剂药物、抗氧化剂和细胞因子拮抗剂等〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种较强的抗氧化剂，研究发现的NAC可能通过膜受体通道抑制细胞内的蛋白激酶C及其上游的蛋白质激酶，抑制中性白细胞释放超氧阴离子的产生〔2〕。临床研究结果也表明，NAC对IPF的肺功能恶化有明显延缓作用，改善肺活量和弥散功能，尤其常规剂量的3倍以上(600 mg/d)，但其具体机制尚不明了〔3〕。Toll样受体(TLRs)是新近发现的先天性免疫系统中的细胞跨受体，能够识别病原体相关分子和损伤相分子，其中 TLR4在炎症反应中的作用尤为显著〔4，5〕，最近研究发现TLR4在动物急性或慢性炎症和肺间质纤维化的发病中起到重要作用〔6〕。本研究探讨NAC对人离体嗜中性粒细胞细胞内活性氧(ROS)水平和TLR4表达的影响。

1 材料与方法

1.1试剂 LPS及NAC购自美国Sigma公司；人嗜中性粒细胞分离试剂盒购自加拿大的Stemcell公司；单克隆MyD88和β-actin 购自美国的Cell Signaling公司；二抗过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白G抗体购买于美国Laboratories公司。Ficoll 购自美国的GE公司。其他所有试剂均为分析级。

1.2密度梯度离心法分离嗜中性粒细胞 用密度梯度法分离正常健康人外周静脉血的嗜中性白细胞。用Krebs-Ringer-phosphate 缓冲液(KRP；pH 7.4)冲洗细胞三次〔7〕；细胞计数使上述缓冲液中含嗜中性粒细胞数为1×106cells/ ml。

1.3用流式细胞仪方法测定细胞内氧自由基 用流式细胞仪测定不同浓度(50，100，150，200 μmol/L)NAC对嗜中性粒细胞产生ROS的影响。在RPIM 1640培养基中加入上述分离细胞3×106，用10 μmol/L的 5-(and-6) -chloromethyl-29，79-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，acetyl ester (CM-H2DCFDA)处理10 min，再用1 μg/ml LPS和上述浓度的NAC处理细胞10 min。用PBS缓冲液冲洗细胞二次。用ROS荧光探针二氢乙啶 (DHE)染色，应用流式细胞仪检测(CA)，激发波长：488 nm，发射波长：530 nm。LPS的荧光值为基础值100%〔8〕。每个试验做5次，取平均值。

1.4Western印迹法检测嗜中性粒细胞MyD88磷酸化的水平 1 ml的KRP预处理上述嗜中性粒细胞(1×106个/ ml)后，37℃下用1 μg/ml LPS孵化嗜中性粒细胞3 min ，加入不同浓度(50，100，150，200 μmol/L)的NAC，用45%三氯醋酸0.5 ml终止反应(最终浓度为15%)。置于冰中反应30 min后，在4℃下离心30 min，用1∶1(容量比)乙醚和乙醇的混合液冲洗三次，每个试管中加入蛋白质溶解液(pH6.8)50 μl。用12% SDS-PAGE分离蛋白质〔7〕，用转写仪转写到PVDF上，用5%蛋白液冲洗PVDF膜3次。用特异性抗原抗体反应检测骨髓样分化因子88(MyD88的磷酸化)。免疫荧光剂(ECL)检测蛋白质磷酸化。

2 结 果

2.1NAC对人离体嗜中性粒细胞释放超氧阴离子的作用 NAC呈剂量依赖性抑制LPS诱导的人嗜中性粒细胞ROS的产生，浓度为50和100 μmol/L时，可明显抑制ROS的产生可达到(80.1±5.5)%和(55.0±6.5)%，随着浓度的增加，抑制越明显，在浓度为150和200 μmol/L时，分别可达到(42.1±9.7)%和(30.2±13.3)%(P<0.01)。

2.2NAC对人离体嗜中性粒细胞MyD88磷酸化的影响 LPS可增加嗜中性粒细胞蛋白质MyD88的磷酸化，NAC呈剂量依赖性抑制LPS诱导的人嗜中性粒细胞MyD88的磷酸化，浓度为50和100 μmol/L时，抑制程度达到(85.5±5.9)%、(51.7±7.8) %(P<0.01)，随着浓度的增加，抑制越明显，在浓度为150和200 μmol/L时，分别可达到(30.6±12.3) %和(10.2±3.3) %(P均<0.01)。NAC也呈剂量依赖性抑制MyD88的磷酸化，与抑制ROS相平行。见图1。

1～6：空白组、LPS组、50、100、150、200 μmol/L NAC组

3 讨 论

NAC为呼吸道黏液溶解剂，作用机制是分子中的巯基能使痰中黏蛋白的二巯键断裂，使黏蛋白分解，对脱氧核糖核酸纤维亦有裂解作用。近年研究表明NAC和各种抗氧化药物一样可恢复人体内耗竭的抗氧化剂水平，保护肺脏不受氧自由基的损伤。NAC具有抗炎作用，可抑制嗜中性粒细胞的功能，包括直接抑制黏附分子的表达和细胞迁移〔9〕。

肺纤维化的早期肺泡上皮细胞受损，就释放血小板衍生因子PDGF、转化生长因子TGFα、TGFβ、内皮素-1，PGF2。Ⅰ型上皮细胞受损，Ⅱ型上皮细胞增生。中性粒细胞到达肺内后，短时间内就可释放氧自由基，弹性硬蛋白酶、组织蛋白酶和胶原酶等，能损伤肺组织。嗜中性粒细胞通过模式识别受体识别微生物的代谢产物，其中 TLR4主要通过MyD88依赖性途径和非MyD88依赖性途径激活下游的激酶，前者可激活NF-κB和MAPK信号通道，与嗜中性粒细胞释放超氧阴离子有关〔10〕。本研究发现抗氧化剂NAC可以通过抑制人嗜中性粒细胞TLR4-MyD88的表达，抑制细胞内ROS的产生。结合以前的研究〔2，11〕，认为NAC可能通过抑制人嗜中性粒细胞TLR4，从而抑制NADPH氧化酶亚单位p47phox的磷酸化和氧自由基的产生，与NAC的抗氧化作用可能与治疗肺间质纤维化有关。

4 参考文献

1Walter N，Collard HR，King TE.Current perspectives on the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Proc Am Thorac Soc，2006；3(4)：330-8.

2王春雷，吕黄伟,李庭富.N-乙酰半胱氨酸对人离体嗜中性粒细胞释放超氧阴离子的影响〔J〕.中国血液流变学杂志，2007；35(12)：22-4,104.

3Maurits D，Behr J，Buhl R,etal.High-dose acetylcysteine in idiopathic pulmonary fibrosis.The IFIGENIA Study〔J〕.N Engl J Med，2005；353 (21)：2229-42.

4Muzio M，Mantovani A.The Toll-like receptor family Munks-gaard〔J〕. Allergy，2001；56(2):103-8.

5Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B,etal.TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced acute respiratory inflammation〔J〕.J Leukoc Biol，2006；80(3)：451-7.

6Yang HZ，Wang JP，Mi S,etal.TLR4 activity is required in the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis after acute and chronic lung injury〔J〕.Am J Pathol，2012；180(1):275-92.

7Lu HW，Sugahara K，Sagara Y,etal.Effect of three flavonoids,5，7，3′，4′-tetrahydroxy-3-methoxy flavone，luteolin and quercetin，on the stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophil〔J〕.Arch Biochem Biophys，2001；393(1):73-7.

8Lorne E，Zmijewski JW，Zhao X,etal.Role of extracellular superoxide in neutrophil activation：interactions between xanthine oxidase and TLR4 induce proinflammatory cytokine production〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2008；294(3)：C985-C93.

9Weiss SJ，Klein R，Slivka A,etal.Chlorination of taurine by human neutrophils.Evidence for hypochlorous acid generation〔J〕.J Clin Invest，1982；70(2):598-607.

10Barton GM，Medzhitov R.Toll-like receptor signaling pathways〔J〕. Science,2003；300(6)：1524-5.

11王春雷,康 健，李振华.还原型辅酶Ⅱ氧化酶蛋白亚单位在特发性肺纤维化患者中的表达〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2007；30(4)：265-8.