不同时间脑缺血/再灌注损伤小鼠大脑Bcl-2和Caspase-3表达的变化

崔芳芹 杨卫东 陈前芬 赵云霞

(蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

研究表明，脑缺血/再灌注损伤(CIRI)是大多数缺血性脑血管疾病的主要病理生理过程〔1〕，其发病机制尚不清楚，而细胞凋亡是CIRI最重要的机制之一〔2〕。目前认为Bcl-2是最重要的抗凋亡基因，具有抑制凋亡的作用。Caspase-3是促凋亡基因，是所有凋亡途径的最后效应子，它们均在成熟脑组织中有少量表达。Bcl-2和Caspase-3表达的改变，将影响缺血神经元的存活或死亡。再灌注损伤与缺血时间有很强的依赖关系，其缺血时间过短或过长，都不会造成严重的CIRI；只有在一定缺血时间段内，恢复血供则易导致严重的CIRI。本实验观察不同缺血时间所引起的再灌注损伤小鼠脑神经元细胞Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的变化。

1 材料与方法

1.1试剂 Bcl-2和Caspase-3的抗体和SP免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2动物与分组 健康昆明种小鼠50只，体重(25±5)g，雌雄兼用，由我院实验动物科提供，随机均分为五组。假手术组:仅行手术，不实施脑缺血；缺血-再灌注(I/R)Ⅰ组:缺血30 min，再灌注1 h；I/RⅡ组:缺血60 min，再灌注1 h；I/RⅢ组: 缺血90 min，再灌注1 h；I/RⅣ组:缺血120 min，再灌注1 h。上述全脑CIRI动物模型的建立，均采用我室改进的小鼠全脑CIRI的动物模型〔3〕，且在10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉后进行。

1.3标本制备 各组动物动态观察到预定的时间后，用20%乌拉坦过量麻醉处死，开颅，取出小鼠大脑，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，48 h 后于乳头体及视交叉平面行冠状切开，制成脑组织切片(厚度为3 μm)。

1.4免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法染色：①石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液修复；②3%H2O2，37℃孵育15 min；③山羊血清封闭，37℃孵育30 min，勿洗；④一抗为兔抗鼠Bcl-2和Caspase-3抗体，稀释浓度均为1∶100，4℃过夜；⑤ 37℃孵育30 min；⑥二抗为生物素标记的山羊抗兔的IgG，37℃孵育15 min；⑦辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育30 min；⑧以上各步骤之间都磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次×5 min；⑨ DAB显色3 min，自来水冲洗；⑩苏木精复染2 min，自来水冲洗，脱水，透明和封片。用PBS替代第一抗体作为阴性对照。

1.5计算机图像分析 在10×40倍光镜下，利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组免疫组化染色切片中Bcl-2和Caspase-3的图像，每张切片随机选取5个视野，再用metamorph生物图像软件计算各组Bcl-2和Caspase-3免疫阳性细胞的平均光密度(MOD)值。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果 在各组小鼠脑组织Bcl-2和Caspase-3免疫组织化学染色切片中，高倍镜下，可见假手术组Bcl-2和Caspase-3免疫反应阳性物主要沉积在大脑上皮神经元细胞的胞质内，呈浅棕色，细胞核呈阴性反应；I/RⅠ组脑神经元细胞内Bcl-2和Caspase-3表达较假手术组增强，呈棕黄色；I/RⅡ组脑神经元细胞内Bcl-2和Caspase-3表达较假手术组明显增强，呈棕褐色；I/RⅢ组脑神经元细胞内Bcl-2表达较I/RⅡ组明显减少；I/RⅣ组脑神经元细胞内Bcl-2表达I/RⅡ组显著减少；I/RⅢ组脑神经元细胞内Caspase-3表达较假手术组显著增强，呈深棕色；I/RⅣ组脑神经元细胞内Caspase-3表达I/RⅢ组显著减少，呈棕色。见图1，图2。

图1 小鼠脑神经元细胞内Bcl-2表达(SP法，×400)

图2 小鼠脑神经元细胞内Caspase-3表达(SP法，×400)

2.2计算机图像分析结果 在一定缺血时间范围内，Bcl-2随缺血时间的延长而表达增加，其中I/RⅡ组Bcl-2的MOD值分别与假手术组和I/RⅠ组比较，均有显著差异(P<0.05)；但缺血时间进一步延长，I/RⅢ组和I/RⅣ组Bcl-2表达逐渐减少，分别与I/RⅡ组的MOD值比较均有显著差异(P<0.05)。Caspase-3表达随着缺血时间的延长而不断增加，I/RⅠ组、I/RⅡ组和I/RⅢ组Caspase-3的MOD值分别与假手术组比较，差异均有显著性(P<0.05)；I/RⅡ组和I/RⅢ组Caspase-3的MOD值分别与I/RⅠ组比较均有显著差异(P<0.05)；I/RⅡ组和I/RⅢ组Caspase-3的MOD值相互比较有显著差异(P<0.05)；但缺血时间过久，I/RⅣ组Caspase-3减弱，与I/RⅢ组Caspase-3的MOD值比较有显著差异(P<0.05)。见表1。

表1 五组小鼠脑神经元细胞内Bcl-2和Caspase-3的MOD值比较

3 讨 论

据WHO调查表明脑血管意外引起的死亡率占所调查的57个国家死亡总人数的11.3%, 仅次于癌症和心肌梗死，脑缺血是脑血管疾病最主要的病种, 在我国其死亡率仅次于恶性肿瘤, 严重危害人类的健康〔4〕。目前对脑缺血性疾病的防治，仍然是全社会和医学界关注的重要课题〔5〕。CIRI是大多数缺血性脑血管疾病的主要病理生理过程，其发病机制不是很清楚，主要有自由基学说、钙超载学说、线粒体功能障碍及迟发型神经元死亡(DND)学说等〔6〕。脑缺血后缺血中心区域的神经元很快出现死亡，但其周围的神经元却发生迟发性神经元死亡，已证明这种迟发性死亡主要是细胞凋亡，它的发生受许多细胞外因素和细胞内基因的调节〔3〕；如何减轻CIRI缺血半暗带区的细胞凋亡，对缺血性脑血管疾病患者的预后具有决定性的作用。目前认为Bcl-2基因家族在凋亡中发挥重要作用, Bcl-2在脑内的过量表达可增强脑组织对缺血性损伤的耐受性, Bcl-2可以通过与Bax竞争结合, 形成异源二聚体, 封闭Bax形成孔道的活性, 阻止ctyc穿过线粒体膜进入细胞质, 从而抵抗细胞凋亡〔7〕，因此调节其基因表达对脑缺血具有重要的治疗潜力。近年研究发现，Caspase 家族在凋亡过程中起重要作用，凋亡的最后过程是通过Caspase 的激活而实现的〔8〕。Caspase-3是参与凋亡Caspase 级链反应最终效应子，在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置，在正常情况下以无活性的酶原形式存在于胞质中，在凋亡的早期阶段不同的蛋白酶切割Caspase-3 酶原，从而激活Caspase-3；活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞死亡。Caspase-3 是多种凋亡途径的共同下游效应部分，细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在凋亡的信息传递中居于核心地位，因此Caspase-3在细胞凋亡早期启动与执行过程中起重要作用〔9〕，是细胞凋亡发生的关键酶。

缺血后再灌注可能造成更严重的损伤，但并不是所有缺血的器官在血流恢复后都会发生CIRI，许多因素可以影响其发生及其严重程度，其中最主要的因素是缺血时间。缺血时间短，恢复血供后可无明显的再灌注损伤，因为所有器官都能耐受一定时间的缺血。缺血时间长，恢复血供则易导致CIRI；若缺血时间过长，缺血器官会发生不可逆性损伤。再灌注损伤与缺血时间的依赖关系，提示在缺血过程中组织发生的某些变化，是再灌注损伤发生的基础，再灌注损伤的实质就是将缺血期的可逆性损伤经恢复血流后进一步加重或转化为不可逆性损伤。本实验研究发现Bcl-2、Caspase-3在正常的脑神经元细胞的胞浆内均有少量的表达。I/RⅢ、I/RⅣ组随着缺血时间的进一步延长，而Bcl-2的表达越来越弱，这可能与脑组织长时间缺血导致细胞能量代谢障碍有关〔2〕。Caspase-3 的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标，并与细胞凋亡的形态学表现相互关联〔10〕。

综上，在缺血后的受损神经元中, 凋亡启动和凋亡抑制基因均有上调, 凋亡启动基因代表细胞死亡趋势, 凋亡抑制基因过度表达代表内源性神经保护机制。若早期应用Caspase 抑制剂，能有效抑Caspase 活性的增加，减少神经细胞的凋亡，改善神经细胞功能〔11〕。在细胞凋亡过程中，Bcl-2及其家族成员起重要作用，它们共同构成一个非常复杂的相互作用网络，抑制细胞凋亡，在脑缺血早期采用积极的方法促进Bcl-2基因的表达，可能会减轻神经系统的损害〔12〕。

4 参考文献

1董银凤,陈前芬. 硫酸镁对小鼠脑缺血再灌注损伤后一氧化氮及ATP酶的影响〔J〕. 蚌 医学院学报,2010；35(4):330-3.

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3冯春生,马海春,岳 云,等.异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时NF-kB活化和Bcl-2、Caspase-3基因表达的影响〔J〕.中华麻醉学杂志,2006；26(5):456-7.

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7张 强,熊 婷,张其梅,等. 缺血后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2和Bax蛋白表达的影响〔J〕. 细胞与分子免疫学杂志,2011；27(3)：329-30.

8赵玉鑫,王 洪,杨述华,等. 川芎嗪对大鼠脊髓损伤后caspase-3 表达及细胞凋亡的影响〔J〕. 中国中医骨伤科杂志，2006；14(6):54-7.

9Hayashi T ,Sakurai M ,Abe K,etal. Apoptosis of motorneurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia〔J〕. Stroke,1998；29 (5):1007-13.

10Sasaki C ,Kitagawa H ,Zhang WR ,etal. Temporal profile of cytochrome c and caspase-3 immunoreactivities and TUNEL staining after permanent middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕. Neurol Res,2000；22 (2):223-8.

11Springer JE ,Azbill RD ,Nottingham SA. Calcineurin mediated BAD dephosphorylation activates the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury〔J〕.J Neurosci,2000；20(19):7246-51.

12王宇卉,卞杰勇,强 华,等.G半胱氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠脑缺血模型DNA损伤的实验研究〔J〕.中国临床康复,2003；7(7):1064-5.