15-脂氧化酶在动脉粥样硬化形成中的作用及卡维地洛的干预效果

董 宾 杨金辉 赵慧颖

(吉林大学第一医院老年病科，吉林 长春 130021)

炎症和一些氧化应激反应可能是动脉粥样硬化(AS)，AS发展的关键因素〔1〕。15-脂氧化酶(15-LO)是一种非铁血红素氧化酶，可以氧化游离多不饱和脂肪酸，其产物15-羟基二十碳四烯酸能够通过增加内皮细胞细胞间黏附因子(ICAM)-1的表达来促进单核细胞的黏附；15-LO氧化脂质的活性增高或过表达可加速早期AS的发生，而抑制15-LO及其产物的活性则可显著延缓AS的发生与发展，因此被认为与AS密切相关。卡维地洛是一种非选择性的肾上腺素能受体阻滞剂,兼有β受体和α1受体的双重阻滞作用,并且有抗氧化和抗细胞增殖作用，能阻抑氧自由基对血管内皮细胞及平滑肌细胞的损伤，广泛用于心力衰竭、高血压、冠心病等疾病的治疗。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 健康雄性Wistar大鼠，体重220～250 g，购自吉林大学实验动物中心。主要实验药品卡维地洛(达利全，购自上海罗氏制药有限公司)，肿瘤坏死因子(TNF)-α(购于武汉博士德生物工程有限公司，EK0526)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所第一分所，A001)， 15-LO一抗(购于上海麦莎生物科技有限公司，MS-1460)1∶150。SP试剂盒和液体二氨基联苯胺(DAB)酶底物显色试剂盒(购于广州市宝泰克生物科技有限公司)。

1.2仪器与设备 主要实验器材：UV-260紫外分光光度计(日本岛津公司)，微量式转移器(德国Gilson公司)，标准规格酶标仪(美国雷博公司)。

1.3动物模型制备与分组 30只健康雄性Wistar大鼠，适应喂养1 w后，随机分为以下三组：①正常对照组10只，饲以正常饲料。②AS组10只，饲以促AS饲料。促AS饲料在正常饲料基础上加入2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、维生素D3粉剂(1.25×106μg/kg饲料)、3%猪油。③ 卡维地洛组10只，以促AS饲料及卡维地洛20 mg/kg体重，1次/d灌胃。实验开始予②、③组大鼠30万U/kg体重维生素D3右下肢肌肉注射，每3周重复给予上述剂量维生素D3右下肢肌肉注射。实验过程中正常对照组因腹泻死亡1只，AS组在注射维生素D3第2天不明原因死亡1只，卡维地洛组因腹部皮肤脓肿死亡1只。

1.4标本处理 9 w后，所有大鼠均禁食24 h，以戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔麻醉，剪开腹部正中皮肤及肌肉，分离腹主动脉，在肾动脉分叉下剪开腹主动脉，插入深静脉插管，用注射器采集动脉血。之后剪下胸腹主动脉及颈总动脉，自主动脉弓下约1 cm处留取动脉组织1 cm立即用4%甲醛溶液固定，用于常规形态学和免疫组织化学检查，离心后的血清置于-20℃冰箱保存以备用。

1.5检测指标 血脂的检测：在吉林大学第一临床医院生化科完成。SOD的检测按照SOD试剂盒说明内的书进行。TNF-α的检测,动脉组织行苏木素-伊红(HE)染色，15-LO 行免疫组织化学染色。免疫组化结果半定量分析：在彩色图像分析系统上，每个切片随机取5个高倍视野，15-LO在血管的阳性表达以面密度表示，同上述方法测5个视野，计算公式：面密度=目标总面积/统计场总面积。

2 结 果

2.1体重变化 AS组、卡维地洛组体重在3 w后较实验前明显增高(P<0.01)，其后6、9 w时体重与3 w时无明显变化，组间各时期体重变化无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2血脂改变 9 w后血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与正常对照组比较，其他两组明显升高(P<0.01)，而这两组间无明显差异(P>0.05)。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与正常对照组相比，其他两组明显降低(P<0.01)，而这两组间无明显差异(P>0.05)。见表2。

表1 各实验组体重变化情况

表2 实验9 w后各组血脂变化情况

2.3血清中SOD和TNF-α的含量 9 w后测得血清中SOD与正常对照组比较，AS组SOD含量〔(185.8±4.1)U/ml〕明显降低(P<0.01)，卡维地洛组〔(214.5±17.8)U/ml〕与正常对照组〔(223.8±12.7)U/ml〕比较无统计学意义(P>0.05)；血清中TNF-α与正常对照组〔(45.3±1.2)pg/ml〕比较，其他两组明显升高〔AS组(62.1±4.9)pg/ml、卡维地洛组(50.7±1.9)pg/ml〕(P<0.01)，而这两组间也有明显差异(P<0.01)。

2.4各组主动脉病理形态学检测 正常对照组胸主动脉壁各层结构清晰，内皮细胞完整，中层平滑肌细胞排列正常无增生，外层为疏松结缔组织；AS组可见动脉内膜呈偏心性增厚，斑块内充满泡沫细胞，内膜有大量炎细胞及增生的平滑肌细胞，中层平滑肌细胞增生；卡维地洛组血管内膜其间可见少量散在的脂质沉积、炎症细胞和泡沫细胞，中膜平滑肌细胞均无明显增生。见图1。

2.5各组大鼠主动脉内膜15-LO的阳性表达 正常对照组血管内膜均未见明显的15-LO阳性表达；AS组的内皮细胞胞浆可见15-LO表达明显增多，呈棕褐色，部分呈点状、片状着色；卡维地洛组的内皮细胞胞浆中见少量15-LO表达。见图2。

正常对照组

AS组

卡维地洛组

正常对照组

AS组

卡维地洛组

2.615-LO表达的半定量分析 15-LO的阳性表达用面密度表示：AS组(1.247±0.071)与正常对照组(0.058±0.008)、卡维地洛组(0.148±0.017)比较，动脉内膜15-LO的表达明显升高(P<0.001)；卡维地洛组与正常对照组比较， 15-LO的表达也有所升高(P<0.05)。

3 讨 论

AS的发病机制是复杂的病理过程，与多种因素有关，近年来损伤-反应学说和由此发展而来的炎症理论较为全面地解释了粥样斑块的形成过程,得到较为广泛的认可。脂质的氧化和对内皮细胞的损伤，以及脂质沉积的长期刺激导致泡沫细胞形成和平滑肌细胞增殖在AS的发生发展中起到重要作用，同时近年研究发现,参与粥样斑块形成过程的细胞和分子与参与炎症反应的细胞和分子相同,从而炎症理论得到了发展和完善〔2〕。目前认为动脉粥样斑块从发生发展到转归的全过程就是一个慢性炎症过程，多种炎性因子、生长因子等在粥样斑块形成中起重要作用〔3〕。

本实验参照郭延松等〔4〕的实验方法建立大鼠AS的模型，结果显示卡维地洛具有明显的抗AS作用，又有明显的抗氧化作用。炎症因子TNF-α是ICAM表达的强效诱导剂，加速了AS的发生和发展过程。临床试验也发现高脂血症、冠心病患者血清有较高水平的TNF-α，并与冠心病的危险性增加及AS的严重性密切相关，故认为TNF-α是促使AS发展的主要细胞因子〔5〕。本实验表示在AS形成过程中TNF-α起到一定作用；卡维地洛能够通过抑制炎症因子TNF-α的表达而起到抗AS的作用。

15-LO是一种非铁血红素氧化酶，在人体内不仅可以氧化游离多不饱和脂肪酸，更可直接氧化复杂底物，除此之外，还有人发现，纯化15-LO可在体外氧化人的LDL，因此被认为与AS中LDL的氧化密切相关〔6〕。其后的研究发现，在人和兔的AS斑块中活性15-LO蛋白、mRNA与巨噬细胞以及oxLDL并存〔7〕。并有大量动物实验显示，15-LO的活性增高或过表达可加速早期AS的发生，而抑制15-LO及其产物的活性则可显著延缓动脉粥样症的发生与发展,这都表明15-LO的高表达在AS中有重要作用〔8〕。本研究说明在AS形成中15-LO表达明显增高，即卡维地洛明显抑制了15-LO的表达，由此说明，卡维地洛通过抑制15-LO的表达而达到其抗氧化的作用。除此之外，还有文献报道，15-LO氧化脂质的产物15-羟基二十碳四烯酸能够通过增加内皮细胞ICAM-1的表达来促进单核细胞的黏附〔9〕。

4 参考文献

1Ponnuswamy P,Schrottle A,Ostermeier E,etal.eNOS protects from atherosclerosis despite relevant superoxide production by the enzyme in apoE mice〔J〕.PLoS One,2012;7(1):e30193.

2Migdal C,Serres M.Reactive oxygen species and oxidative stress〔J〕.Med Sci(Paris),2011；27(4):405-12.

3Libby P.Inflammation in atherosclerosis〔J〕.Nature,2002；420(6917):868-74.

4郭延松,吴宗贵,杨军柯,等.三种大鼠动脉粥样硬化模型复制方法的比较〔J〕.中国动脉硬化杂志,2003;11(5):465-9.

5Zhang H,Park Y,Wu J,etal.Role of TNF-α in vascular dysfunction〔J〕.Clin Sci(Lond),2009；226(3):219-30.

6Kleemann R,Zadelaar S,Kooistra T.Cytokines and atherosclerosis a comprehensive review of studies in mice〔J〕.Cardiovasc Res,2008；79(3):360-76.

7Pratico D,Tangirala RK,Rader DJ,etal.Vitamin E suppresses isoprostane generation in vivo and reduces atherosclerosis in ApoE deficient mice〔J〕.Nat Med,1998；4(10):1189-92.

8Huo Y,Zhao L,Hyman MC,etal.Critical role of macrophage 12/15-lipoxygenase for atherosclerosis in apolipoprotein E -deficient mice 〔J〕.Circulation,2004;110(14):2024-31.

9Bolick OT，Orr AW，Whtzel N，etal.12/15-Lipoxygenase Regulates intercellular adhesion molecule-1 expression and monocyte adhesion to endothelium through activation of rho a and nuclear factor- B〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005；25(11):2301.