壳寡糖对S180荷瘤鼠P53、Bcl-2蛋白表达的影响

官 杰 兴桂华 庄旭东 王 琪

(齐齐哈尔医学院免疫教研室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

几丁质又名壳多糖、甲壳质，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外骨骼和真菌细胞壁及一些绿藻中，是由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成的多糖。几丁质经脱乙酰化处理后得到壳聚糖。海洋壳聚糖是一种由β-1,4-糖苷键连接而成的多糖，进一步解聚可以生成水溶性壳寡糖，后者具有多种生物活性。近十几年来，壳聚糖的研究已在国内外广泛展开，它们具有免疫调节、抗肿瘤及降血脂等功能，但由于其不溶于水，在开发应用上受到很大限制。壳寡糖不但水溶性好，易被人体吸收，还展现出独特优越的多种生理功能，主要表现在：能够调节动物肠道内微生物代谢活动，选择的活化有益菌，促进双歧杆菌生长〔1〕；促进抗体生成、抑制肿瘤生长〔2,3〕；降低血压、血糖、吸附胆固醇；活化植物细胞、促进植物细胞快速增长〔4〕等。其抗肿瘤作用主要是通过直接抑制细胞增生、诱导细胞坏死和凋亡、影响肿瘤血管生成和迁移、增强机体免疫力实现的。本文以S180荷瘤鼠作为研究对象，通过体内实验，观察壳寡糖对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，探讨壳寡糖抗肿瘤作用机制,为壳寡糖临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂、动物及仪器 壳寡糖由哈尔滨工业大学提供；环磷酰胺由上海华联制药有限公司生产；P53单抗、Bcl-2单抗免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；S180瘤株，由哈尔滨医科大学免疫教研室提供，昆明小鼠，雌雄各半，质量18～22 g，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。

1.2方法

1.2.1实验方法 取腹腔接种S180瘤株10 d的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水，放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4%台盼蓝生理盐水液计数(其活细胞>95%)。用生理盐水调细胞浓度至1×108/ml，备用。取昆明小鼠(雌雄各半)30只，将其随机分为模型组、壳寡糖组(15 mg/ml)、环磷酰胺(CY)组，每组10只。各组均造模，每只小鼠右腋下皮下注射0.2 ml瘤细胞悬液制备动物模型。模型组用生理盐水腹腔注射，每天0.02 ml/g；壳寡糖组用壳寡糖(15 mg/ml)给小鼠腹腔注射，每天0.02 ml/g；CY组于小鼠腹腔注射CY，每天20 mg/kg。各组小鼠均于接种后次日给药，给药1次/d，连续10 d。

1.2.2免疫组织化学技术检测P53、Bcl-2蛋白表达 脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤组织，10%甲醛固定，常规处理，石蜡包埋，连续组织切片4～6 μm，二甲苯脱蜡至水。免疫组化染色采用两步法，其步骤严格按照试剂盒要求进行。染色结果判定：Bcl-2和P53染色阳性标志为棕黄色颗粒，Bcl-2主要表达在细胞核或胞质，P53主要表达在胞质。光镜高倍镜观察，随机选择10个视野，计算1 000个细胞的阳性细胞数。

2 结 果

2.1各组小鼠P53表达水平 与模型组(60.2±7.4)比较，壳寡糖组(46.5±6.9)和CY组(48.2±3.5)瘤组织中P53表达水平降低(P<0.05)；壳寡糖组与CY组比较无显著差异(P>0.05)。见图1。

2.2各组间小鼠Bcl-2表达水平测定 与模型组(73.6±8.0)比较，壳寡糖组(43.2±9.5)和环磷酰胺组(42.6±8.8)瘤组织中Bcl-2基因表达水平均降低(P<0.05)；壳寡糖组与CY组比较，两者无显著性差异(P>0.05)。见图2。

图1 各组小鼠P53表达水平(IH，×400)

图2 各组小鼠Bcl-2表达水平(IH，×400)

3 讨 论

在医药领域，壳寡糖主要用于抗肿瘤、抗感染、降低血清胆固醇等作用。在抗肿瘤方面，壳寡糖对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用并能提高促凋亡基因Bax的表达，降低抑凋亡基因Bcl-2的表达〔5〕。壳寡糖还能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力〔6〕。本课题前期工作结果：壳寡糖可抑制肿瘤生长〔7〕，提高机体免疫功能，同时壳寡糖可诱导肿瘤细胞凋亡〔8〕。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，又称程序性细胞死亡(PCD)。肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖和分化的异常，而且也与肿瘤细胞凋亡的失控密切相关。P53作为一种抑癌基因具有抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞增殖的作用。Bcl-2 作为一种原癌基因无论是在生理和肿瘤形成的情况下, 均可以通过抑制细胞凋亡而促进增殖细胞的恶性转化和肿瘤细胞的生长, 从而干预肿瘤的发生发展。本实验结果说明壳寡糖能够有效调节肿瘤组织P53、Bcl-2的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，延缓了肿瘤发生的进程。

本实验从P53、Bcl-2局部提示壳寡糖可影响肿瘤细胞的基因水平，而肿瘤是多基因异常所致疾病，壳寡糖抑制肿瘤生长在基因水平的作用是对上述基因特异的作用，或是对多种癌基因和抑癌基因非特异作用有待进一步研究。

4 参考文献

1竺国芳,赵鲁杭.几丁寡糖和壳寡糖的研究进展〔J〕.中国海洋药物,2000;19(1):43-6.

2Feng J,Zhao L,Yu Q.Receptor-mediated stimulatory effect of oligochitosam in macrophages〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,2004;317(2):414-20.

3吴海明，华晓阳，何登全.壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机制的研究〔J〕.中华医学研究杂志，2005;5(8)：729-32.

4胡志鹏.壳寡糖的研究进展〔J〕.中国生化药物杂志，2003;24(4)：210.

5刘清华,孔庆兖,柳 红. 壳寡糖对S180肉瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的影响〔J〕.徐州医学院学报，2006;26(4)：290-3.

6曹秀明，徐海娇，尚 明，等.壳寡糖抗肿瘤和免疫调节作用的实验研究〔J〕.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2006;22(4):8-10.

7官 杰,罗晓庆，王 瑛，等.壳寡糖抑制肿瘤作用的实验研究〔J〕.中国免疫学杂志,2007;23(5):421-5.

8官 杰,王 琪,王 慧,等.壳寡糖对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响〔J〕.免疫学杂志,2009;25(2):195-7.