丝胶对糖尿病大鼠胰岛细胞神经肽Y表达的影响

刘 平 刘东慧 付秀美 陈志宏

(承德医学院，河北 承德 067000)

既往关于2型糖尿病的研究多集中于胰岛β细胞，鲜有研究报道除胰岛β细胞以外其他胰岛细胞的功能状态及与β细胞之间的关系。神经肽Y(NPY)是从猪脑中提取的含36个氨基酸的多肽，属胰多肽家族成员，广泛分布于哺乳动物的器官和组织，参与调节机体的多项生理功能〔1,2〕。NPY在哺乳动物胰岛中主要由α细胞表达〔3〕。本研究通过观察彩色蚕茧水提取物——丝胶对糖尿病模型大鼠胰岛α细胞NPY蛋白表达的影响，探讨丝胶对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物的选择及分组处理 36只3月龄清洁级健康雄性SD大鼠，体质量200～250 g(合格证号：712024)，购自河北医科大学实验动物学部。随机选取其中的12只作为正常对照组，常规饲养，腹腔注射同等剂量链脲佐菌素(STZ)溶剂(pH4.4的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小剂量STZ连续腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg，3 d)，7 d后检测空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作为2型糖尿病动物模型成功的标准〔4〕；然后再随机分为糖尿病模型组和丝胶治疗组，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常对照组、模型组大鼠灌胃给予同等剂量的生理盐水35 d。

1.2药物与试剂 STZ，美国Sigma公司；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；兔抗NPY多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，彩色蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供。

1.3检测血糖 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦取血，3 000 r/min离心20 min后分离血清，-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4检测胰岛细胞NPY蛋白的表达 大鼠取血后断头处死，取胰腺用Bouins液固定后常规石蜡包埋，Leica石蜡切片机连续切片，片厚5 μm。免疫组化SP法观察胰岛细胞NPY的表达：一抗稀释浓度为1∶50，4 ℃孵育过夜；二抗(工作液)37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应。NPY免疫阳性结果定量分析：采用MiVnt图像分析系统在显微镜下(10×40)对免疫组化阳性结果进行定量分析，每张切片随机选取胰岛作为观察视野，计算阳性产物面积占胰岛面积的比值。每组随机选取5只大鼠，每只大鼠任选5张切片，每张切片选取3个胰岛，取平均值。

1.5统计学方法 应用SPSS15.0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠的血糖 糖尿病模型大鼠的血糖明显高于正常对照组大鼠(P<0.01)；丝胶治疗组大鼠的血糖明显低于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。见表1。

2.2各组大鼠胰岛细胞NPY的表达 NPY蛋白免疫阳性产物为棕黄色颗粒状，位于胰岛α细胞胞质。与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠胰岛α细胞NPY蛋白的表达明显升高(P<0.01)；丝胶治疗组大鼠胰岛α细胞NPY蛋白的表达明显低于糖尿病模型组大鼠(P<0.01)。见表1，图1。

表1 各组大鼠的血糖和胰岛α细胞NPY的表达

正常对照组

糖尿病模型组

丝胶治疗组

3 讨 论

蚕茧为蚕蛾的茧壳，性甘、温，无毒，可滋阴润燥、生精止渴，主治多饮、不生肌肉、肾消白浊和上中二消。民间有蚕茧泡水降血糖的验方，本课题组的前期研究亦发现，丝胶(彩色蚕茧水提取物)可明显降低血糖和调节血脂代谢紊乱，保护糖尿病时胰岛细胞损伤和性腺功能障碍〔5～7〕。

NPY与多食、多饮、生长发育迟缓等病理生理过程有关，并且参与糖尿病微血管病变、肾脏病变及视网膜病变等并发症的发生发展〔8〕。NPY由胰岛α细胞合成和分泌，可通过自分泌和旁分泌的方式调节胰岛素的分泌〔9〕。有研究发现，NPY与胰岛β细胞分泌的胰岛素间存在着反馈调节机制：NPY可抑制β细胞分泌胰岛素，β细胞分泌的胰岛素反过来通过旁分泌作用抑制NPY的合成和分泌〔10〕。本研究发现，与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠胰岛α细胞NPY的表达明显升高。糖尿病时胰岛β细胞分泌胰岛素的水平降低，因而对NPY的反馈抑制作用减弱，导致NPY合成和分泌增多；增多的NPY又抑制胰岛素的分泌，使胰岛素的分泌进一步减少，从而产生恶性循环〔11〕。同时，还有学者发现NPY具有较强的缩血管效应，可增加血管外周阻力，因此认为糖尿病时NPY表达增加是导致糖尿病微血管病变的重要原因之一〔12,13〕。由此可见，NPY的高表达与糖尿病的发生发展密切相关。

丝胶为蚕茧中约占30%的具有多种生物活性的水溶性蛋白质，其中的氨基酸以丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等为主，在传统对蚕茧的应用中多作为废料丢弃。本研究通过浸泡、水煎、过滤、浓缩获取丝胶蛋白，结果发现丝胶治疗组大鼠胰岛α细胞NPY的表达明显低于糖尿病模型组大鼠，表明丝胶可通过下调胰岛α细胞NPY蛋白的表达，减弱NPY蛋白高表达对胰岛β细胞分泌胰岛素的抑制作用，并减弱NPY的缩血管效应，进而改善糖尿病及其并发症的症状。丝胶是天然的蛋白质，可避免化学合成药物带给人体的副作用，因此可能具有良好的推广应用前景，但相关机制有待进一步的深入研究。

4 参考文献

1Evanson KW,Stone AJ,Samraj E,etal.Influence of estradiol supplementation on neuropeptide Y neurotransmission in skeletal muscle arterioles of F344 rats 〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2012;303(6):R651-7.

2Walther C,Mörl K,Beck-Sickinger AG.Neuropeptide Y receptors: ligand binding and trafficking suggest novel approaches in drug development 〔J〕.J Pept Sci,2011;17(4): 233-246.

3Bennt WM,Wang ZL,Jone PM,etal.Presence of neupropeptide Y and its messenger ribonucleic acid in human islet:evidence for a possible paracrine role〔J〕.Clin Endocrinol,1996;81(6):2117-20.

4向雪松，王 竹，祝宇铭，等.链脲佐菌素注射剂量对建立2型糖尿病大鼠模型的影响〔J〕.卫生研究,2010;39(2):138-42.

5付秀美，钟美蓉，陈志宏，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(1)：103-5.

6宋成军，付文亮，陈志宏.丝胶预处理对2型糖尿病大鼠睾丸生殖细胞的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(13)：2459-61.

7刘晓燕，付秀美，高 宇，等.丝胶对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(12)：2525-7.

8Szczepanska-Sadowska E,Cudnoch-Jedrzejewska A,Ufnal M,etal.Brain and cardiovascular diseases: common neurogenic background of cardiovascular,metabolic and inflammatory diseases 〔J〕.J Physiol Pharmacol,2010;61(5):509-21.

9Schwetz TA,Ustione A,Piston DW.Neuropeptide Y and somatostatin inhibit insulin secretion through different mechanisms〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2012〔Epub ahead of print〕.

10Sindelar DK,Mystkowski P,Marsh DJ,etal.Attenuation of diabetic hyperphagia in neuropeptide Y-deficient mice〔J〕.Diabetes,2002;51(3):778-83.

11Imai Y,Patel HR,Hawkins EJ,etal.Insulin secretion is increased in pancreatic islets of neuropeptide Y-deficient mice〔J〕.Endocrinology,2007;148(12):5716-23.

12DeLorey DS,Buckwalter JB,Mittelstadt SW,etal.Is tonic sympathetic vasoconstriction increased in the skeletal muscle vasculature of aged canines 〔J〕?Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010;299(5):R1342-49.

13马 进，卢 盟，窦焕芝.2型糖尿病患者血浆NPY和Hcy测定的临床意义〔J〕.河南预防医学杂志，2007；18(1)：16-7.