不同饮食结构建立的2型糖尿病肾病大鼠模型比较

芝 敏 梁新华 徐佩茹

(新疆医科大学第一附属医院肾病科，新疆 乌鲁木齐 830000)

糖尿病合并高血压的模型目前多采用的是SHR高血压大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，但缺陷是先有高血压，然后才出现糖尿病，不符合临床糖尿病患者出现高血压的自然病程。研究〔1,2〕表明，高血压是导致糖尿病肾病肾损伤加重的重要因素，即便在微量白蛋白尿期，合并高血压的糖尿病肾病患者的肾病进展速度也要明显快于未合并高血压者。本研究通过对高糖高脂饲料及高盐高脂饲料两种不同饲料喂养+单肾切除+STZ腹腔注射制作的2型糖尿病肾病大鼠模型的比较，旨在探索更合理的2型糖尿病肾病的造模方式。

1 材料与方法

1.1实验动物 8周龄SD雄性大鼠36只(由新疆医科大学动物实验中心提供)，体重(170±30)g，于新疆医科大学第一附属医院动物实验中心饲养，12 h周期节律，自由摄食水。

1.2饲料、试剂、仪器 高脂高糖饲料(10%蔗糖， 3%蛋黄粉，10%猪油，77%普通饲料)，高脂高盐饲料(10%猪油，5%氯化钠，3%蛋黄粉，82%普通饲料)，由新疆医科大学动物实验中心进行加工。STZ购自Sigma公司，胰岛素试剂盒购自北京北方生物研究所。

1.3造模方法 随机分成三组，每组12只，先用普通饲料适应性喂养1 w后，测定血压、血糖，确定基线无差异(P>0.05)，禁食12 h，将氯胺酮(100 mg/2 ml)、 地西泮(10 mg/2 ml)、 阿托品各1支(0.5 mg/ml)混合后，用生理盐水稀释至10 ml， 再按0.75 ml/100 g体重计算用量，给予腹腔麻醉，在背部肋脊角下方脊柱旁开2 cm，切开皮肤及肌肉、腹膜，找出肾脏，沿肾门结扎后，切除左肾，缝合肌肉及皮肤。术后开始分别给予高盐高脂(A)组、高糖高脂(B)组及正常饲料(C)组喂养。4 w后给予内眦取血测空腹血清胰岛素，恢复2 d后禁食12 h，按20 mg/kg给予STZ，使用前用0.1 mol/L pH4.2柠檬酸缓冲液配制成1%STZ溶液，间断3次腹腔注射(每次间隔2 d)，C组给予腹腔注射柠檬酸缓冲液。STZ腹腔注射72 h后尾尖测血糖≥16.7 mmol/L，即为糖尿病造模成功，继续分别给予上述饲料喂养12 w。

1.4鼠尾动脉血压检测 使用成都泰盟科技有限公司的NIBP-1A无创血压测定分析系统进行鼠尾动脉血压检测。预热仪器，把大鼠用固定盒固定，暴露鼠尾安装调试好压力感受器，放入恒温箱中30 min，待大鼠安静且波形稳定后测量，每只记录3次，取均数为此次血压的测定值，每4 w测1次。

1.5生化及一般指标检测 STZ注射后72 h大鼠尾尖采血并用拜安捷血糖仪检测血糖。各组大鼠每2 w给予称体重，并测空腹血糖。16 w后禁食，代谢笼留取24 h尿测定尿微量白蛋白后，称体重，腹腔麻醉下开腹，腹主动脉采血，3 000 r/min离心5 min后取血清，Beckman全自动生化仪进行血脂、血糖、肾功、离子、白蛋白的检测，同时摘取右肾，称重并记录重量，计算肾重/体重，切取一半肾组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片行HE及Masson染色，同时切取米粒大小肾组织于戊二醛中固定，送电镜检查。

1.6病理检测并计算肾小球硬化指数 每片选取20个完整的包括血管极及尿极的肾小球，根据Raij等〔3〕的半定量方法评估肾小球硬化程度，根据肾小球硬化灶占肾小球比例分为5级(肾小球无病变为0级，肾小球损伤不足25%为1级，损伤26%～50%为2级，51%～75%为3级，76%～100%为4级)，计算肾小球硬化指数。每张标本低倍镜下随机观察5个肾小管间质视野，依据文献〔4〕作为肾小管间质损伤指数的评分指标，以5个视野评分均值表示肾小管间质损伤指数。

1.7统计方法 使用SPSS13.0版统计学分析软件对数据进行方差分析和q检验。

2 结 果

2.1大鼠的成模情况及胰岛素抵抗情况 STZ腹腔注射后大鼠出现多饮、多食、多尿、消瘦、毛发枯黄，A组死亡2只，B组死亡1只，B组在实验过程中2只出现牙周感染。A组空腹胰岛素(39.73±12.71)mIU/ml，B组(51.81±16.98)mIU/ml，C组(21.84±9.84)mIU/ml，3组有统计学差异(F=9.996，P=0.001)。A组与B组无明显差异，而两组与C组均有统计学差异，提示产生了胰岛素抵抗。

2.23组大鼠不同时期血压比较 3组血压基线水平一致，不同饮食喂养后第4周起A组虽出现了血压升高，但无统计学意义(P>0.05)，第8周A、B组血压也高于C组，A组在第12周时血压水平最高，到第16周血压较12 w血压略有回落。B组16 w的血压与基线水平无明显差异，而A组16 w血压则明显高于起始点水平。见表1。

2.33组大鼠各种生化指标的对比 除肌酐外，A、B组指标与C组均有统计学差异，其中A组的24 h尿微量白蛋白、肾指数高于B组，而总胆固醇的指标A组则低于B组(P均<0.05)。见表2。

表1 3组大鼠不同时间收缩压变化

表2 各组大鼠生化指标的差异

2.43组大鼠光镜下及电镜下病理改变 3组肾小球直径有统计学差异(P<0.05)，A、B两组肾小球〔(112.67±8.13)μm;(107.64±9.2)μm〕较C组〔(86.14±4.65)μm〕明显肥大，但A、B两组无统计学差异。8只A组大鼠可见肾小管内蛋白管型，7只可见肾小动脉管壁增厚，A、B两组大鼠均可见肾小管上皮细胞空泡变性，电镜下A、B两组与C组比较均可见足突广泛融合甚至消失，基底膜局灶性增厚，系膜区基质增多，系膜细胞增生，部分可见肾小管内细胞器增多。见图1～3。肾小球硬化指数及肾小管间质损伤指数见表3。

表3 各组肾小球硬化指数及肾小管间质损伤指数对比

图1 不同组大鼠肾脏病理改变(HE,×400)

图2 不同组大鼠肾脏纤维化情况(Masson，×200)

a:基底膜呈不规则增厚，并有足突融合及消失；b：系膜细胞增生及系膜区增宽

3 讨 论

糖尿病合并高血压的患病率在20%～50%左右，已有充分的证据表明，高血压参与了糖尿病肾病的发病，且加速了糖尿病肾病的进展〔1，2〕。孙兆峰等〔5〕使用高盐高脂饮食+STZ注射建立了2型糖尿病伴高血压大鼠的模型，明确了高盐高脂饲料喂养可以诱导出大鼠的胰岛素抵抗及高血压，但对其对肾脏的损害未进行探讨。Catherine等〔6〕在给STZ诱导的糖尿病大鼠不同浓度的(1%与3%)高盐饮食后发现并未产生明显的高血压，也未产生明显的肾脏损害，并发现高盐饮食后反而明显减轻了糖尿病肾病的高滤过，并认为可能是由于高盐饮食使致密斑的Na+浓度正常化，进而减少了肾素的分泌。研究表明，当盐含量达到4%～5%或8%时，可以诱导出糖尿病合并高血压的大鼠模型〔7〕。本研究提示：①在一定范围内增加糖尿病大鼠饮食中的盐含量，并不能诱导出高血压，相反还可以降低糖尿病肾病早期的高滤过，也不会造成肾小球的损害，超过了一定限度后，血压会出现升高，并引起肾损害的加重，这可能与高盐饮食在一定程度降低了体内醛固酮的水平有关。②高盐高脂饮食较单纯的高盐饮食可能更易诱导出糖尿病大鼠模型盐敏感性高血压的形成。③单肾切除的糖尿病大鼠具有更明显的肾脏高灌注、高滤过、高压力，因此更易诱导出盐敏感性高血压的发生及肾脏损伤的加重。

综上，高盐饮食能诱发糖尿病肾病大鼠更加明显的高血压，同时加重微量白蛋白尿，因而可能更适合做2型糖尿病合并高血压的肾病动物模型。

4 参考文献

1Bidani AK，Picken M，Hicioglu R，etal.Spontaneously reduced blood pressure load in the rat streptozotocin-induced diabetes model:potential pathogenetic relevance〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2007;292:F647-54.

2Glassock RJ，Cohen AH，Adler S.Primary glomerular diseases〔M〕.In:Brenner BM ed. The kidney.Philadelphia:PA.W.B.Saunders,1994：630-6.

3Raij L, Azar S, Keane W. Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats〔J〕.Kidney Int，1984；26:137-43.

4Radford MG，Donadio JV，Bergstralh EJ，etal.Predicting renal outcome in IgA nephropathy〔J〕.J AM Soc Nephrol,1997；8:199-207.

5孙兆峰，王 利，张 玲,等.伴高血压2型糖尿病大鼠模型的建立〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(9)：1078-80.

6Catherine L,Ian S,Michael T,etal.Salt-resistant blood pressure and salt-sensitive renal autoregulation in chronic streptozotocin diabetes〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009;296：1761-70.

7Orie NN, Aloamaka CP, Iyawe VI. Enhanced sensitivity to salt-induced high blood pressure in diabetes mellitus〔J〕. Res Exp Med (Berl),1994;194:197-202.