灰树花多糖联合顺铂对H22肝癌移植瘤小鼠的抑瘤作用研究

吕冬霞 杜 伟 范晓艳 王晓丽 李 玉

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

灰树花多糖(PGF)是从优质灰树花子实体中提取的有效活性成分，研究表明PGF具有抗肿瘤作用〔1，2〕。本研究采用免疫组化法检测半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3，Caspase-8，细胞色素C(Cytc)在PGF联合顺铂诱导H22肿瘤细胞凋亡过程中的变化，观察PGF联合顺铂对肿瘤生长的影响，探讨其抑瘤作用机制和细胞凋亡通路。

1 材料与方法

1.1材料 瘤株：H22肝癌细胞购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物中心；实验动物：昆明种近交系雄性小鼠，体重(20±2.0)g，佳木斯大学实验动物中心提供，许可证号：黑动字第99101001，普通级，普通环境饲养。PGF粉末：浙江方格药业有限公司，多糖含量为90%。顺铂粉剂：山东齐鲁制药厂。Caspase-3，Caspase-8，Cytc抗体：南京基美生物。SP-9001试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒：北京中杉金桥。

1.2方法

1.2.1动物模型建立 取昆明种近交系小鼠40只，分别接种1×107/ml细胞悬液于右侧腋下，随机分成四组，每组10只。

1.2.2实验分组及给药方式 用生理盐水溶解顺铂和PGF。接种24 h后开始给药。给药时间：每日早上进行灌胃1次，晚上进行腹腔注射1次，间隔时间12 h，连续给药14 d。具体给药方法见表1。

表1 实验动物的给药种类、方式与用量

1.2.3皮下肿瘤生长实验 实验结束后，观察肿瘤状态，完整剥取肿瘤后测量移植瘤质量和体积。平均瘤体积=(a × b2)/ 2 (a、 b分别为肿瘤长径和短径)。q 值= E(A+ B )/ EA + EB(1-EA)〔EA、 EB 、 E(A+ B)分别为PGF组、 顺铂组及联合组的抑瘤率〕根据q值判断联合用药的疗效，q<0.85为拮抗，q值0.85～1.15为相加，q>1.15为协同。

1.2.4Caspase-3、Caspase-8、Cytc表达检测 采用SP法进行免疫组化操作。分别观察制片后的Caspase-3、Caspase-8、Cytc表达，Caspase-3为细胞膜和细胞质着色，Caspase-8和Cytc为细胞浆着色，着色成棕黄色或褐色的是阳性细胞。显微镜下选取每个区域不重复随机10个高倍视野(×400)，观察所选择视野中的所有细胞，记录阳性染色细胞百分数并计分。

评分标准如下：IHS=A×B。A为阳性细胞数分级0～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)。对所得数值进行完全随机设计两样本均数比较t检验。

2 结 果

2.1皮下肿瘤生长实验 接种后，小鼠成瘤率100% ，在第1～3天，各组移植瘤生长情况基本相同；第4～14天，对照组移植瘤生长快于其他组，联合组肿瘤生长最慢；解剖可见肿瘤质硬，表面有血管生长分布。从平均瘤块体积来看，用药组瘤块体积低于对照组(P<0.05，P<0.01)；与联合组比较，PGF组、顺铂组均有差异(P<0.05)，而对照组有显著性差异(P<0.01)。各组平均瘤块体积、瘤质量及抑瘤率，见表2。

表2 各组平均瘤质量及瘤块体积

2.2单独及联合治疗对H22肝癌移植瘤细胞Caspase-3、Caspase-8、Cytc表达影响 见表3。与对照组比较，顺铂组与PGF组Caspase-3，Caspase-8，Cytc的阳性率差别有统计意义(P<0.05)；与联合组比较，对照组差别有显著统计学意义(P<0.01)，各单药组差别有统计学意义(P<0.05)。

表3 小鼠移植瘤Caspase-3，Caspase-8，Cytc蛋白表达

3 讨 论

顺铂是目前临床上治疗肿瘤最常用和较有效的化疗药物之一，大量或较长期使用，容易产生毒副作用、多药耐药性。本研究表明PGF和顺铂联合体内抗肿瘤具有相加作用，说明PGF可通过增加顺铂对癌细胞的敏感性而增强抗癌作用。

诱导细胞凋亡的因素很多，这些因素都需要激活不同的Caspase家族成员，才能导致细胞凋亡，故Caspase被认为是细胞凋亡的核心执行者即凋亡的共同通路〔3，4〕。Caspase-3属于效应Caspase〔5〕,是多数细胞凋亡途径中的末端效应蛋白酶。Caspase-8是死亡受体介导的凋亡途径中关键的启动因子，细胞凋亡依赖一类对Caspase产生的级联反应，能够通过自身切割活化，激活下游Caspase，产生凋亡效应〔6，7〕。Cytc是一种可溶性多肽，定位于膜间隙，并与线粒体内膜疏松结合。近来，有一系列的研究表明，Cytc是通过和dATP与Apaf1及Caspase-9结合，从而活化Caspase-3而起作用〔8〕。

综上，顺铂、PGF、联合组既通过死亡受体途径又通过线粒体途径诱导H22肿瘤细胞凋亡，且PGF可通过增加顺铂对癌细胞的敏感性而增强抗癌作用。

4 参考文献

1杜景卫，夏作理，李清初，等.灰树花多糖抗S180肉瘤的实验研究〔J〕.泰山医学院学报，2005；25(2):195-7.

2吕冬霞，杜 伟,范晓艳,等.灰树花多糖联合顺铂对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响〔J〕.黑龙江医药科学，2011；34(3):72.

3Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998；18(11):6353-64.

4Rao RV,Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001；276(36):33869-74.

5Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，etal.Identification and inhibition of the ICE/ CED - 3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕 .Nature，1995；376(6535):37-43.

6Zhang W，Shi HY，Zhang M.Maspin overexpression modulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins〔J〕.BMC Cancer，2005；5(1)：50.

7Werner AB，Vries E，Tait SW，etal.Bcl-2 family member Bfl-1/A1 sequesters truncated bid to inhibit its collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax〔J〕.J Biol Chem，2002；277(25)：22781-8.

8Li P ，Nijhawan D ，Budihardjo I，etal.Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/ caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade〔J〕.Cell，1997；91(4):497-89.