去卵巢对大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

周 君 何红晨 刘慧芳 郭 华 夏 璐 陈世菊 覃渝茜 何成奇

(四川大学华西医院康复科 四川省康复医学重点实验室，四川 成都 610041)

研究发现Wnt/β-catenin信号传导通路涉及骨骼发育的各个方面，激活 Wnt/β-catenin信号通路能促进成骨细胞始祖细胞增殖和分化，增加成骨细胞的活性，从而促进新骨形成，增加骨密度〔1，2〕。骨质疏松发生的分子生物学机制可能涉及Wnt/β-catenin信号通路的改变〔3，4〕。本研究观察去卵巢对SD大鼠Wnt/β-catenin信号通路中的低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、β-catenin mNRA表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料与设备 双能X线骨密度测量仪(Dexa，美国)；奥林巴斯光学显微镜(日本)；Laica切片机(德国)；FTC2000实时荧光定量基因扩增仪(Funglyn，加拿大)；雌二醇(E2)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)酶联免疫法试剂盒(罗氏公司，美国)；LRP5单克隆抗体(Genetex ，美国)，β-catenin单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；Trizol试剂(Invitrogen，美国)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas，德国)，Taq DNA PCR反应试剂盒(Takara,中国)，其余试剂均为市售分析纯。3月龄未育雌性SD大鼠20只，由四川大学华西医院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1分组与造模 实验动物饲养于四川大学华西医院动物实验中心，清洁级环境。适应性饲养1 w后，按随机数字表法把20只实验大鼠随机分为正常对照组和去势组，每组10只。参照Gregory等〔5〕对去势组大鼠施行双侧卵巢切除术，术后每只大鼠肌肉注射青霉素4万U，1次/d，连用3 d以预防感染。正常对照组大鼠不作任何处理。每只实验大鼠分笼饲养在温度20℃～26℃，湿度60%～70%，12 h间隔照明自由摄食。

1.2.2标本采集及处理 去势手术后12 w，眼眶取血2 ml，室温静置2 h，低温3 000 r/min离心15 min，每份分3次用移液管取上层血清约300～500 μl，分别置于3个1.5 ml EP管中，于-70℃ 冰箱中保存备用。

1.2.3血清E2、BALP和TRACP5b检测 采用ELISA，严格按照试剂说明书操作，测定血清E2、BALP和TRACP5b水平。

1.2.4骨密度测定 双能X线骨密度测量仪测定实验动物左股骨骨密度。处死大鼠后，迅速取出左侧股骨、剥离肌肉、生理盐水冲洗,将股骨放在盛有深约2.5 cm的蒸馏水(用于模拟股骨周围的软组织)的容器中，用小动物软件进行扫描。

1.2.5LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR检测 参照Trizol说明书，提取大鼠右股骨中骨髓的总RNA，参照试剂盒说明书进行RT-PCR，采用β-actin作为内参。LRP5引物上游：5′-GACATTTACTGGCCCAATGG-3′，引物下游5′-CTGCCCTCCACCACCTTCT-3′，引物间片段长131 bp；β-catenin：引物上游： 5′-GGAAAGCAAGCTCATCATTCT-3′，引物下游5′-AGTGCCT GCATCCCACCA-3′，引物间片段长171 bp；β-actin：引物上游5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′，引物下游5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′，引物间片段长114 bp。PCR反应条件：①94℃ 2 min ②94℃ 20 s，55℃ 30 s，60℃ 40s，共45个循环。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数(Ct值)，将原始数据(Ct值)换算为基因的相对表达量(2-ΔΔCt)用于统计分析。

1.2.6Western印迹检测 取大鼠右股骨中骨髓100 mg提取蛋白， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 并将蛋白转至硝酸纤维素膜上； 分别加入LRP5及β-catenin单克隆抗体，4℃孵育过夜；二抗常温下孵育2 g行DAB显色和定量分析，利用图像分析软件测定电泳条带的光密度值，目的蛋白相对定量值=目的蛋白条带光密度值/β-actin蛋白条带光密度值。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0软件行组t检验。

2 结 果

2.1血清E2、BALP和TRACP5b水平 手术后12 w去势组血清E2水平为(23.94±6.69)pg/ml，比正常对照组(42.70±12.48)pg/ml显著降低(P<0.01)；去势组的血清BALP水平为(108.50±7.23)U/L，比正常对照组(91.30±7.31)U/L显著增加(P<0.01)；去势组的血清TRACP5b水平为(12.92±2.94)U/L，比正常对照组(8.54±2.33) U/L显著增加(P<0.01)。

2.2骨密度检测 手术后12 w去势组的左股骨密度 (0.242±0.020) g/cm2,比正常对照组(0.281 ±0.021)g/cm2下降13.9%(P<0.01)。

2.3RT-PCR检测 去势组β-catenin mRNA表达(2.49±0.84)比正常对照组(1.14±0.65)显著增高(P<0.05)，尽管去势组LRP5 mRNA表达(1.62±0.94)比正常对照组(1.05±0.33)高，但两组差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.4Western印迹检测 去势组β-catenin 蛋白表达(0.31±0.13)比正常对照组(0.21±0.05)显著增高(P<0.05)，尽管去势组LRP5 蛋白表达(0.31±0.13)比正常对照组(0.20±0.03)高，但两组差异没有统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 两组大鼠骨髓中LRP5和β-catenin 蛋白的表达

3 讨 论

Wnt/β-catenin信号通路是一种进化非常保守的信号通路，从低等生物到高等哺乳动物都广泛存在，在生物发育、细胞转运及细胞凋亡等生命过程中发挥重要作用并且与肿瘤的发生密切相关〔6〕，Wnt/β-catenin信号通路还可以通过干细胞更新、促进成骨细胞始祖细胞增殖和分化、诱导成骨细胞发生、抑制成骨细胞和骨细胞凋亡等机制，促进新骨形成，增加骨密度〔2〕。经典Wnts信号通路的细胞分子包括Wnts、LRP5、β-catenin和T细胞因子/淋巴增强子结合因子(TCF/LEF)等。

LRP5是成骨细胞膜上Wnts的辅助受体；能诱导细胞内一系列的信号传递，在骨骼系统发育和维持骨量的过程中起到重要作用。在人类功能缺失的LRP5基因突变导致以骨密度降低为特点的骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征的发生,而功能获得性LRP5基因突变引起骨密度增加〔3〕。

β-catenin是一种钙黏蛋白，它直接与钙黏素和肌动蛋白细胞支架连接，对细胞黏附和迁移很重要，调节细胞增殖和生存，是Wnt/β-catenin 信号通路的重要组成部分〔7〕，是经典Wnts信号通路激活的必要条件〔8〕，在有Wnts信号存在时，Wnts信号通过蛋白Disheveled、轴蛋白(Axin)和Frat-1传递至抑制β-catenin的蛋白质复合物(APC)，Axin和糖原合成酶激酶3(GSK3)并抑制GSK3的活性，释放β-catenin，从而β-catenin在胞质内聚集并进行核转位，在核内，它与TCF/LEF转录因子相互作用，介导Wnts对基因转录的多种效应〔1，2，9〕。本研究结果提示去势大鼠Wnt/β-catenin信号通路被激活，基于β-catenin在骨形成的重要作用〔8〕，推断去卵巢促进了大鼠新骨的形成，这从去势大鼠的血清BALP显著增高得到证实，因为BALP反映成骨细胞活性，可以作为骨形成的生化指标〔10〕。但是去势大鼠的骨密度总趋势是下降的，这是因为去势后，雌激素降低导致骨吸收增加，在本研究结果说明大鼠去势后骨吸收增加，骨吸收大于骨形成最终导致骨密度下降。本研究结果说明去卵巢12 w后大鼠Wnt /β-catenin信号通路被激活，在去势大鼠骨组织代谢和骨重建过程中起到重要作用。然而一项研究〔11〕发现大鼠去卵巢4 w和8 w后Wnt /β-catenin信号通路被抑制。究其原因，Wnt/β-catenin信号通路在去势大鼠中的功能状态可能与去卵巢的时间有关。

本研究提示β-catenin介导的经典Wnts信号通路被激活。Wnt /β-catenin信号通路作为促进骨形成机制的核心〔4〕，该通路所涉及的靶位或因子有望成为开发新的抗骨质疏松药物的潜在作用位点。研究发现〔12〕电针足三里、三阴交能促进去势大鼠LRP5、β-catenin的表达，激活Wnt /β-catenin信号通路，从而增加骨密度。然而，由于该信号通路参与了很多基本的生命过程，如胚胎的发生、组织器官的生成等〔13，14〕，而且此通路的激活与肿瘤的发生密切相关〔6，15，16〕，因而通过激活Wnt/β-catenin信号通路的机制来治疗骨质疏松的靶向药物及各种治疗方法的安全性和副作用，需深入研究和全面评估。

4 参考文献

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