Hsa-miR-9在结直肠癌组织中的表达水平及意义

胡 亮 韩建波 龙启强 张郁丰 陶志坚 易永祥

(东南大学附属第二医院肿瘤外科，江苏 南京 210003)

内源性非编码小RNAs又称微小〔RNA(miRNA)〕〔1〕不编码蛋白质，但可以通过降解或抑制靶mRNAs的翻译来调节蛋白编码基因的表达〔2〕,在调节生物体的生长发育、细胞分化和凋亡及肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用，能在转录后或者翻译水平影响基因的表达，成为近年研究的热点。与正常细胞相比，肿瘤细胞中miRNA存在异常表达，包括异常上调或异常下调。多个研究发现，Hsa-miR-9在神经肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、淋巴瘤的肿瘤组织中表达上调在肿瘤的发生、发展和转移中起重要作用〔3～8〕。由于miRNA具有组织特异性，不同细胞来源的肿瘤应该会有不同的miRNA上调或下调〔9〕。本研究拟观察Hsa-miR-9在结直肠癌组织中表达水平，以及与结直肠癌临床病理参数之间的关系。

1 材料与方法

1.1病例标本 结直肠癌组织标本来自2004年1月至2007年6月初次就诊且未同时合并其他肿瘤的结直肠癌手术患者，共66例。男44例，女22例；平均58.34岁；均为腺癌；高分化癌5例，中分化癌35例，低分化癌26例；病理pTNM(UICC2003分期标准)分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例。手术前均未接受放化疗。

1.2qRT-PCR检测Hsa-miR-9在结直肠癌组织中的表达水平 按照固定组织RNA提取试剂盒使用说明书从组织中提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA提取液的A260吸光度值，计算浓度后-20℃保存备用。按照逆转录试剂盒使用说明书将所得总RNA逆转录为总cDNA，-20℃保存备用。按照qRT-PCR试剂盒使用说明书，用qRT-PCR检测结直肠癌标本miR-9的表达水平。内参选用U6、实验重复3次。用引物设计软件Primer5.0设计qRT-PCR引物：Hsa-miR-9qRT-PCR引物：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′，反向5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′；U6-snRNAqRT-PCR引物：正向5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，62℃ 45 s，共40个循环。

1.3统计分析 采用SPSS13.0软件行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

结直肠癌组织Hsa-miR-9表达水平的高低与年龄、性别、肿瘤发生部位、大体形态无显著相关性(均P>0.05)，而与肿瘤分化程度、肿瘤浸润程度、有无淋巴转移及远处转移相关。见表1。

表1 结直肠癌组织中Hsa-miR-9表达水平与临床病理特征的关系

3 讨 论

人miR-9有23个核苷酸，有3种类型：miR-9-1、miR-9-2和miR-9-3，分别定位于1q22、5q14.3、15q26.1，在多种肿瘤发生发展中起着重要作用。只有成熟的miRNA-9才能发挥作用，与其他蛋白质组成RNA诱导沉默复合体(RISC)，该复合体与靶mRNA结合，从而引起靶mRNA的降解或翻译抑制〔10,11〕。当miRNA与靶基因结合位点完全互补配对时引起mRNA降解，不完全互补配对则导致翻译抑制〔12～14〕。在人和动物体内，大部分miRNA与靶mRNA间的碱基配对为不完全互补配对，因而主要造成mRNA翻译的抑制，而不是mRNA的降解〔15〕。在肿瘤组织中染色体常发生缺失、增加或重排现象，而miRNA位于染色体的脆性位点，因此异常表达的miRNA可能在肿瘤形成中扮演重要角色，可能是控制细胞增殖和调亡的抑癌基因或致癌基因〔16,17〕。miRNA表达的改变可以导致遗传信息表达的改变从而导致相应的病理生理状态，而处于一定病理生理状态的组织常伴有特定的miRNA表达〔18〕。miR-9在多种肿瘤发生发展中起着重要作用。对肿瘤miRNA表达研究可有助于多种癌症的分型和预后判断〔19〕。

本实验发现Hsa-miR-9表达水平与结直肠癌的临床病理特征以及临床分期之间有相关性，随着结直肠癌的病情进展而表达水平增高。当肿瘤浸润程度增加，分化程度恶化，出现淋巴结转移或远处转移时患者癌组织中Hsa-miR-9的表达水平明显升高。提示miRNA与结直肠癌的发生、发展及转移密切相关。本研究证实了Hsa-miR-9在结直肠癌进展不同临床阶段患者中存在显著差异，结直肠癌患者癌组织中Hsa-miR-9表达水平高低可能成为一个评价疾病进展及不良预后的独立指标。

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