血必净对内毒素血症大鼠炎症反应的保护作用及心肌AngⅡ和Toll受体-4表达的影响

王叶舟

(福建医科大学附属第一医院干部病房，福建 福州 350003)

内毒素血症(ETM)是一种临床常见的危重急症，主要病因为细菌释放大量内毒素进入血液，不仅可继发器官损伤，严重者可导致休克甚至死亡〔1〕。内毒素在ETM发病中仅起触发作用，而由内毒素引发的炎症反应至关重要，多种炎症因子参与了ETM的发病过程，因此控制炎症反应是缓解ETM的根本措施〔2,3〕。心脏是ETM的主要受累器官，机体释放的一系列炎症因子，可影响肾素-血管紧张素系统，导致循环障碍，加重了细胞缺血、缺氧〔4，5〕。Toll样受体4(TLR-4)介导炎症反应，在ETM大鼠心肌细胞中表达升高〔6〕。血必净(XBJ)是一种中药材提取物，具有活血化瘀、疏通经络、溃散毒邪的作用，可拮抗内毒素并抑制炎症反应〔7〕，故推测XBJ也可用于ETM治疗。本研究观察XBJ对ETM炎症反应的改善作用，同时分析其对心肌血管紧张素(Ang)Ⅱ和TLR-4水平的影响。

1 材料与方法

1.1试剂与主要仪器 脂多糖(LPS)、Triton X100，美国Sigma公司；兔抗鼠β-actin、TLR-4一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，美国Santa Cruz公司；BCA蛋白分析试剂盒，碧云天生物科技公司；血浆肿瘤坏死因子(TNF)-α、C-反应蛋白(CRP)和白介素(IL)-6，南京建成生物工程研究所；AngⅡ试剂盒，中国北方生物技术研究所；TLR-4、β-actin引物由宝生物工程(大连)有限公司合成；XBJ注射液(10 ml/支)，天津红日药业。

1.2动物与分组 选取8周龄的雄性SD大鼠30只并采用阴茎背静脉注射8 mg/kg LPS诱导ETM大鼠模型，根据实验设计分3组(n=10)：LPS组，LPS+ XBJ组和LPS+地塞米松(DEX)组。LPS+XBJ组和LPS+DEX组在注射LPS的同时分别给予XBJ 5 ml/kg和DEX 5 mg/kg。选取同批次的10只正常大鼠作对照(对照组)，仅给予等体积生理盐水。所有大鼠在实验前均饲养于相同环境下(安静、湿度60%～70%且12 h/12 h明暗周期)，可自由获取饮水、饮食。实验前均至少喂养1 w，待大鼠状态稳定后进行相应实验。

1.3血浆炎症因子及心肌AngⅡ检测 3 h后从右侧颈总动脉采血置于抗凝管中，4℃ 5 000 r/min离心5 min，保留上清，同时静脉注射1 ml KCl使大鼠心脏停在舒张期，迅速取出心脏，采用中性PBS(pH7.4)漂洗，滤纸吸干后修剪心脏，保留左心室并将其剪碎，充分匀浆后12 000 r/min离心10 min，保留上清，样本均于低温冰箱中保存备用。采用酶联免疫吸附法检测各组血浆TNF-α、CRP和IL-6水平，放射免疫法检测心肌组织中AngⅡ水平。以上操作均严格遵守试剂盒说明书。

1.4Western印迹法 采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白法检测心肌组织上清液TLR-4蛋白浓度，加入上样缓冲液充分混匀，煮沸10 min后每孔加入30 μg蛋白，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并采用半干转法转移至醋酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭后，根据膜面积加入TLR-4(1∶200)的一抗，4℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，选择β-actin为内参(1∶3 000)，每步间采用TBST冲洗。采用ECL化学发光法显影，采用 Image Pro Plus软件分析目的条带的光密度。

1.5RT-PCR法 采用RNA提取试剂盒提取心肌细胞的总RNA，干燥RNA沉淀并保存于适量DEPC水中，-80℃保存备用，检测260、280 nm波长下的吸光度(A)并计算A260/A280，同时采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。PCR总反应体系为25 μl，包含2 μl引物(20 μmol/L)、2.5 μl dNTP混合液、0.5 μl AMV-Optimized Taq酶、5 μl MgCl2(25 mmol/L)及4 μg总RNA。TLR-4引物：5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′(正义)，5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′(反义)；内参β-actin：5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′(正义)，5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′(反义)。反应条件：逆转录反应50℃、30 min，94℃、2 min灭活逆转录酶酶；94℃、30 s(变性)，57℃、30 s(变性)，72℃、30 s(延伸)，共30个循环，72℃最终延伸5 min。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，采用Bio-Rad凝胶成像系统分析，TLR-4 mRNA表达量以其与内参的比值表示。

2 结 果

2.1血必净对ETM大鼠血浆炎症因子水平的影响 LPS组、LPS+XBJ组和LPS+DEX组的血浆炎症因子水平均高于对照组(P<0.05)，LPS+XBJ组的TNF-α和IL-6水平均低于LPS组(P<0.05)，与LPS+DEX组的差异均无统计学意义(P<0.05)，但LPS+XBJ组的CRP与LPS组的差异无统计学意义(P>0.05)，且高于LPS+DEX组(P<0.05)，见表1。

表1 各组血浆炎症因子水平比较

2.2血必净对ETM大鼠心肌AngⅡ水平的影响 对照组、LPS组、LPS+XBJ组和LPS+DEX组的心肌AngⅡ水平分别为(68.24±10.28)、(793.85±98.01)、(351.60±75.64)、(149.37±66.82)ng/g，LPS组高于对照组(P<0.05)，XBJ处理可降低LPS诱导的AngⅡ升高(P<0.05)，但与对照组和LPS+DEX组的差异仍有统计学意义(P<0.05)。LPS+DEX组与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3血必净对ETM大鼠心肌TLR-4 mRNA、蛋白水平的影响 LPS组的TLR-4 mRNA、蛋白水平高于对照组(P<0.05)，XBJ处理可降低LPS诱导的TLR-4 mRNA、蛋白水平升高，且与对照组和LPS+DEX组仍有显著差异(P<0.05)。LPS+DEX组与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

1:对照组;2:LPS组;3:LPS+XBJ组;4:LPS+DEX组

表2 各组心肌TLR-4 mRNA及蛋白表达水平

3 讨 论

炎症反应在ETM发病中发挥关键作用，可损伤脏器并影响系统功能，故应及时缓解ETM的炎症反应〔2〕。XBJ的主要成分为红花黄色素A，在临床上对多种细菌感染引起的炎症反应均有较好的治疗效果，如重症脓毒症、百草枯中毒及重症胰腺炎等〔7〕。本研究发现给予ETM大鼠XBJ治疗后，可降低其血浆TNF-α、CRP和IL-6水平，表明XBJ对ETM的炎症反应有保护作用，主要与其具有活血化瘀、溃散毒邪和疏通经络的功效有关，可拮抗内毒素的作用〔8〕。

肾素-血管紧张素系统激活是ETM的常见病理生理反应，主要与炎症反应释放的大量炎症因子有关。肾素-血管紧张素系统可影响心血管系统功能，导致循环障碍，加重细胞缺血缺氧，导致病情恶化〔9〕。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的重要组成部分，其水平可用于评价该系统的激活状态〔10〕。本研究发现ETM大鼠的心肌AngⅡ水平升高，提示ETM时心肌的肾素-血管紧张素系统处于激活状态。XBJ可降低心肌AngⅡ水平，表明XBJ可抑制肾素-血管紧张素系统激活，主要与其降低炎症反应有关。以上提示XBJ对心肌具有保护作用。

Toll样受体在ETM的发病过程中起重要作用。心脏是ETM的主要损伤器官，ETM大鼠心肌TLR-4水平升高，提示Toll样受体被激活，在介导心脏局部炎症反应中起作用〔6〕。本研究发现XBJ可降低心肌TLR-4的蛋白和mRNA水平，进一步表明XBJ对ETM心肌损伤的保护作用。但本研究中经XBJ处理后，血浆炎症指标及心肌AngⅡ和TLR-4水平仍与正常大鼠有差异，推测主要原因为剂量不足或作用时间较短，这将是后续研究的重点。

4 参考文献

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