皖北地区Leber遗传性视神经病一家系线粒体突变位点

刘 辉 王 力 鲍明升 王爱莲 吴守伟 赵 莉

(蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233030)

Leber遗传性视神经病变(LHON)目前认为是受母亲遗传的一种视神经病，发病多为年轻男性，其临床症状主要表现为急性或亚急性双眼中心视力下降，通常不伴有眼球疼痛；视野以中心或偏中心暗点居多，通常暗点较大并可向周边扩展，更易向上方延伸或连接包绕生理盲点；视力大多稳定在0.1以下，虽有全盲者但罕见〔1～4〕。本研究探索皖北地区该病是否有突变位点。

1 病例与方法

1.1病例来源 该病家系来源于皖泗县地区，经蚌埠医学院附属医院诊断为LHON，患者为15岁女性，其母亲为携带者，表型正常。舅舅45岁，亦为患者。

1.2基因组DNA提取 在患者及其家属签署知情同意书后，对患者抽取静脉血2～3 ml，并对其家系进行走访，并抽取其母亲和舅舅外周血进行研究。使用全血基因组抽提试剂盒(天根生化科技，北京)提取外周血基因组DNA。为避免外源DNA污染，总DNA提取采用无菌滤纸代替血液样品作阴性对照，提取方法与其他样品完全一样。

1.3引物设计 根据人类线粒体全序列(GenBank登录号：JQ031816)分别设计ND1基因、ND4基因和ND6基因引物。

设计引物对FP(L3202)和RP(L4424)，扩增产物长度为1 242 bp，涵盖全部ND1基因956 bp；由于ND4基因较长，设计两个引物对FP(L10664)和RP(L11489)、FP(L11416)和RP(L12225)，扩增产物长度分别为849 bp和834 bp，拼接后可包含全部ND4基因1 378 bp；设计引物对FP(L14041)和RP(L14837) 扩增产物长度为816 bp，涵盖全部ND6基因525 bp。见表1。

表1 引物名称及序列

1.4ND1，ND4和ND6基因扩增及测序 PCR扩增使用Long Taq DNA聚合酶试剂盒(天根生化科技，北京)，扩增线粒体ND1基因、ND4基因和ND6基因；PCR体系为25 μl，含0.5 μg 模板DNA，上、下游引物各0.5 μl(浓度为10 μmol/L)，Long Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μl)0.5 μl，10×Long Taq Buffer 12.5 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μl，最后用ddH2O补充体积至25 μl。每个反应包含30循环，循环参数为：94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，首次循环前95℃预变性5 min，最后一个循环后72℃再延伸10 min。PCR反应在PTC-200 Thermo Cycler (MJ Research公司)上进行。PCR扩增采用无菌滤纸的提取结果替代模板作阴性对照。扩增结果在1%琼脂糖凝胶中电泳检测，并用紫外凝胶成像系统(BioRad公司)拍照分析。扩增得到的ND1基因、ND4基因和ND6基因产物直接送上海Invitrogen公司测序。

1.5BLAST及数据分析 测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，以确定所测得序列的正确性。然后用CLUSTAL X软件与正常人对应位点的DNA片段进行比对，以寻找是否有新的突变位点，并用MEGA 2.0软件对所测DNA序列进行蛋白质的氨基酸序列进行预测，并探索突变位点是否会引起氨基酸残基的改变。

2 结 果

2.1突变位点分析 发现2个新的突变位点，且具有家系遗传特点：第一个突变位点，位于ND4基因内线粒体全序列第11 196位，由T突变为C(图1，图2)；第二个突变位点，位于ND4基因内线粒体全序列第11 770位，由G突变为A(图3，图4)。

2.2突变位点对应预测氨基酸的分析 所测线粒体DNA序列用MEGA2.0软件预测氨基酸序列，密码子表选用verteabrate mitochondria，来判断所测线粒体DNA序列中所发生的变异位点是否会造成氨基酸序列的改变，从而探讨与LHON的关系。发现ND1，ND4和ND6基因中，两个变异位点所对应的氨基酸位点均发生了改变。在ND4基因中，对应的氨基酸由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)；精氨酸(R)变为组氨酸(H)(图5)这两个变异的位点在这个家族的三个成员中均出现，但是否由于这两个变异位点引起的疾病尚不能下结论，还需深入研究。

方框内示突变位点；ND4、DN4 NPH2和DN4 NP183：正常人线粒体序列，1-ND4和3-ND4为该家系中患者线粒体序列，2-DN4，为该家系中携带者线粒体序列；*正常位点

图2 该家系线粒体ND4基因中第一个突变位点处测序图谱(无乱峰，信号可信)

方框内示突变位点；ND42、DN42 NP183和DN42 NPH2：正常人线粒体序列，1-ND42和3-ND42为该家系中患者线粒体序列，2-DN42，为该家系中携带者线粒体序列；*正常位点

图4 该家系线粒体ND4基因中第2个突变位点处测序图谱(无乱峰，信号可信)

图5 突变位点对应氨基酸变化

3 讨 论

LHON是一种比较少见的遗传性视神经病，有明显家族史，但遗传方式颇为特殊，与孟德尔定律不符，多数患者为男性，仅通过女性传递。在20世纪80年代以前，对于该疾病的发病原因有多种解释，直到近年来，各国学者才普遍认为是由于线粒体的某些基因的位点突变引起的。目前的研究发现该病的主要突变位点发生在编码线粒体呼吸链上的NADH脱氢酶(或复合物Ⅰ)的亚基中〔5，6〕，从而导致呼吸链上的复合物发生改变而引起LHON的发生。目前已知有3个不同的mtDNA原发性突变，分别发生在线粒体核苷酸序列的3460A/ND1，11778A/ND4和14484C/ND63个位点，这3个原发性突变位点被认为是引起LHON的较强的风险因素〔2，7〕，但是，越来越多的研究发现一些新的线粒体序列点突变对于该病的发生也起到一定至关重要的作用〔8～11〕。

自Wallace等〔5〕首先发现LHON可因线粒体DNA核苷酸位点突变引起以来，越来越多的研究人员发现各种不同的mtDNA点突变与本病有密切关系。ND基因在线粒体的研究中越来越受到重视，本研究发现，皖北地区该家系的患者在常见的3个突变位点3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6并未发生点突变，而是有两个新的突变位点：第一个突变位点，位于ND4基因内线粒体全序列第11 196位，为T11196C；第二个突变位点位于ND4基因内线粒体全序列第11 770位，为G11770A。变异位点对应的氨基酸残基也随之发生改变，说明该位点的变异是有意义的，可能是与该疾病的发生有关。目前为止，国内相关研究报道有涉及T14484C 和T14502C〔12〕，G3460A〔13〕，还有ND基因以外其他基因的突变，例如tRNAThr A15951G〔10〕。

本研究发现的新的变异位点只能推测与该疾病的发生有一定的关系，如果要证明某个变异位点与该疾病的发生有因果关系，还需要更多的病例和深入的研究。对于新的变异位点是否是突变，还要排除基因多态性方面的可能，目前还没有可靠的标准，只能参照已知的多态性位点。通过我们的研究，认为在临床上检测，可以通过位点特异性PCR对常见的3个突变位点3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6以及T11196C和G11770A进行筛查。

4 参考文献

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10Qu J，Li R，Zhou X,etal.Cosegregation of the ND4 G11696A mutation with the LHON-associated ND4 G11778A mutation in a four generation Chinese family〔J〕.Mitochondrion，2007；7 (1-2)：140-6.

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12Zhang S，Wang L，Hao Y,etal.T14484C and T14502C in the mitochondrial ND6 gene are associated with Leber′s hereditary optic neuropathy in a Chinese family〔J〕.Mitochondrion，2008;8 (3)：205-10.

13Tong Y，Sun YH，Zhou X,etal.Very low penetrance of Leber′s hereditary optic neuropathy in five Han Chinese families carrying the ND1 G3460A mutation〔J〕.Mol Genet Metab，2010;99 (4)：417-24.