AEG-1表达对老年宫颈癌SiHa细胞周期的影响及相关机制

高婷婷

(宁波市中心医院，浙江 宁波 315000)

宫颈癌常见鳞状细胞癌，是临床多发的女性生殖系统恶性肿瘤，尤其对于老年患者，其复发以及转移成为导致患者死亡的重要因素之一。肿瘤转移是癌细胞与宿主细胞相互作用的连续复杂过程。这个复杂的过程是由一系列基因调控系统组成。研究〔1〕表明，星形细胞上调基因(AEG)-1与肿瘤的发生和发展密切相关，在唾液腺癌、原发性胆囊癌、卵巢癌和乳腺癌等组织中发现AEG-1的表达异常升高；AEG-1在宫颈癌组织中的表达也显著高于正常组织〔2〕，提示AEG-1可能在宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用，但其分子机制尚需探讨。本研究对siRNA介导的AEG-1表达沉默的人宫颈鳞癌细胞SiHa的周期性变化进行研究，并对其发生的分子机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 人正常宫颈组织以及宫颈癌组织均来自于我院近年来收治的宫颈癌患者以及健康体检人群，实验组织均经过病理学检查确认。SiHa细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI 1640培养液和胰蛋白酶均购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，AEG-1-siRNA、siRNA和兔多克隆抗体AEG-1均为美国Zymed公司产品，鼠单克隆抗体cdk2以及兔多克隆抗体eyelin D1均为美国Santa Cruz公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养以及转染 SiHa细胞复苏后，置含5%胎牛血清的DMED培养基中。达到85%～95%细胞融合度时，按照脂质体2000转染试剂操作说明，以siRNA和AEG-1-siRNA转染SiHa细胞。转染后将细胞分为三组：未转染组(不作任何处理)、siRNA对照组和AEG-1-siRNA转染组。

1.2.2Western印迹测定蛋白表达 裂解细胞(细胞数1×107加100 μl lysis buffer)，根据样品蛋白浓度，按蛋白总量50 μg计算体积。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)垂直电泳200 V 90 min，100 V湿法转膜。分别结合I抗〔AEG-1抗体，细胞周期蛋白(cyclin D1)、CDK2、β-actin抗体〕，4℃过夜。Tris盐酸缓冲液(TBS/T)清洗5 min×3遍后，结合Ⅱ抗(HRP-la-beled羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG抗体)，室温1 h，温和振荡。TBS/T振荡清洗5 min×3遍。至暗房，加电化学发光法(ECL)显色液作用1 min，感光、洗片。将所得照片扫描，输入计算机，用Quantity one软件扫描得吸光度值，以AEG-1、细胞周期蛋白cyclin D1、CDK2与β-actin平均吸光度比值做定量分析。实验重复3次。

1.2.3流式细胞仪检测SiHa细胞周期 收集转染后48 h的SiHa细胞(每组约1×106个)，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，置4℃ 70%冰乙醇固定30 min。冷PBS漂洗3次，然后重悬细胞于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNaseA的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。采用流式细胞仪检测样品DNA含量。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较使用t检验。

2 结 果

2.1正常组织、细胞与宫颈癌组织、细胞中AEG-1的表达 正常宫颈组织的AEG-1蛋白表达量(0.03±0.01)显著低于宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量(0.41±0.07)(P<0.05)；SiHa细胞中的AEG-1蛋白表达量显著高于对照细胞中AEG-1蛋白表达量(0.13±0.16)(P<0.05)。

AEG-1-siRNA对SiHa细胞中AEG-1表达有显著地下调作用(P<0.05)，AEG-1-siRNA转染组SiHa细胞中AEG-1表达量(0.16±0.07)显著低于未转染组(0.79±0.11)以及对照siRNA转染组(0.81±0.12)(P<0.05)。

2.2AEG-1表达的下调可以显著增加SiHa细胞在G0/G1期的数量(P<0.05)。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在G0/G1期的比例显著高于未转染组以及siRNA对照组(P<0.05)。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在S期的比例显著低于未转染组以及siRNA对照组(P<0.05),且AEG-1-siRNA组细胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表达显著低于对照siRNA组(P<0.05)。见表1。

表1 AEG-1表达对细胞周期的影响

3 讨 论

近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，如何从分子水平阐明宫颈鳞癌转移发生的分子机制，寻求理想的分子指标进行预后评估，是降低宫颈鳞癌患者病死率的有效途径之一。AEG-1是近年发现的新的基因。随着对AEG-1的深入研究，发现AEG-I不仅促进神经退行性变的发生，还促进肿瘤的进展和转移，是肿瘤的发生发展过程中的一个关键基因〔3〕。AEG-1参与了多种调控细胞增殖、凋产和转移的信号通路的激活。

研究发现〔4〕，AEG-1可以激活肿瘤细胞增殖途径并且减少肿瘤细胞凋亡，因此可以促进其增殖。在乳腺恶性肿瘤和前列腺恶性肿瘤的相关临床研究中发现，细胞周期抑制因子表达的下调有可能与AEG-1表达的上调有因果关系，这些变化可以促进细胞增殖。此外，有研究表明〔5〕，在神经母细胞肿瘤中，抑制AEG-1表达可以引起细胞周期停滞在G0/G1期，抑制细胞分裂增殖。为深入研究AEG-1在宫颈恶性肿瘤中发挥的作用，以AEG-1表达量最多的SiHa细胞为研究对象，使用AEG-1 siRNA转染SiHa细胞，研究显示AEG-1 siRNA转染后48 h，AEG-1蛋白表达量出现明显降低，这一结果为深入研究AEG-1在宫颈恶性肿瘤中发挥的作用提供了良好的基础。现利用流式细胞术进行进一步研究分析，观察转染前后SiHa细胞周期分布的变化，结果显示AEG-1 siRNA组中停滞在G0/G1期的SiHa细胞比率大大高于对照siRNA组和未作任何处理组，而且S期细胞的比率也比对照siRNA组和未作任何处理组于要高，这一结果显示AEG-1表达下调可以诱导细胞周期停滞在G0/G1期，进而可以降低宫颈恶性肿瘤细胞的增殖。深入研究分析表明〔6〕，AEG-1 siRNA转染后，与细胞分裂增殖关系较密切的cdk2和cyclin D1蛋白的表达也出现明显降低，这表明AEG-1诱导出现的宫颈恶性肿瘤细胞周期静止现象可能与cdk2和cyclin D1蛋白表达降低有密切的关系。

本研究结果表明，AEG-1在宫颈鳞癌组织以及细胞中有较高的表达，该蛋白的高表达显著影响了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例显著增加，该现象的分子机制可能与cyclin D1以及CDK2的表达下调有相关性。

4 参考文献

1梁紫影，张兆祥.星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)与肿瘤〔J〕.临床与实验病理学杂志，2011;27(3):297-300.

2Li J，Zhang N，Song LB,etal．Astrocyte elevated gene-1 is a novel prognostic marker for breast cancer progression and overall patient survival〔J〕．Clin Cancer Res，2008;14(21)：3319-26.

3Emdad L, Lee SG, Su ZZ,etal. Astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) functions as an oncogene and regulates angiogenesis〔J〕. Proc Nat Acad Sci, 2009;106(50): 21300-5.

4Brown DM, Ruoslahti E. Metadherin, a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis〔J〕. Cancer Cell, 2004; 5(4): 365-74.

5Li J, Yang L, Song L,etal. Astrocyte elevated gene-1 is a proliferation promoter in breast cancer via suppressing transcriptional factor FOXO1〔J〕. Oncogene, 2009; 28(36): 3188-96.

6崔晓峰，刘爱军，韦立新，等．细胞周期蛋白Gl在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床病理学意义〔J〕．中华病理学杂志，2008;37(3)：165-8.