金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马组织学变化的影响

马飞煜 林 婉 黄林欢 林 麒

(汕头市中心医院暨中山大学附属汕头医院神经内科，广东 汕头 515041)

海马结构在学习、记忆等高级神经活动中起重要作用。阿尔茨海默病(AD)主要累及于此，表现为进行性智力衰退和行为、人格变化。快速老化痴呆模型小鼠(SAMP8)是主要以学习、记忆能力下降为特征的比较理想的自然衰老痴呆模型〔1～4〕。快速老化小鼠(SAMR1)表现为正常衰老，一般作为SAMP的正常对照〔5〕。Uchida等〔6〕首次从人脑组织中分离出金属硫蛋白(MT)3，因其只在脑内特异表达，可能具有重要的神经生理和神经调节功能。临床报道老年痴呆患者脑内MT3含量明显减少〔7〕，引发了许多MT3与AD发病机制的研究。本实验观察MT3对SAMP8小鼠海马组织学变化的影响。

1 材料与方法

1.1动物分组 实验动物均7月龄，雄性，每组20只。SAMP8作为痴呆组，SAMR1作为正常组。将SAMP8随机分成痴呆组、空白对照组(0.2 ml/10 g生理盐水)、低浓度MT3(75 μg/ml)组、中浓度MT3(150 μg/ml)组、高浓度MT3(300 μg/ml)组。由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。连续腹腔注射28 d，停药1 d后备用。

1.2光镜标本制备、HE染色 4%多聚甲醛灌注取脑，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋制成蜡块，每只鼠海马连续发片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇脱水：苏木精染色；盐酸乙醇分化；自来水浸泡；置伊红液；常规脱水，透明，封片。

1.3透射电镜标本制备 用2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液灌注取脑，再置于4%戊二醛、锇酸中固定；梯度酒精脱水；环氧树脂包埋；制备半薄切片定位后，超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染，备电镜观察。

2 结 果

2.1各组小鼠海马CA1区HE染色结果 SAMP8组海马CA1区结构不清，锥体细胞数量减少，排列紊乱；很多细胞核体积变小、深染，呈核固缩表现；胶质细胞明显增生。SAMR1组海马CA1区结构清晰，锥体细胞数量未见减少，细胞排列较整齐、均匀，细胞形态正常，结构完整。低、中、高浓度MT3组海马CA1区锥体细胞较空白对照组结构较清晰，排列较整齐均匀，胶质细胞减少；中浓度MT3组有锥体细胞脱失；低、中浓度MT3组形态学不如高浓度MT3组规整；高浓度MT3组海马CA1区锥体细胞排列较整齐均匀，细胞形态结构较清晰(图1)。

2.2各组小鼠海马CA1区神经元透射电镜超微结构结果 SAMP8组大部分神经元体积变小，核不规则，胞质内有较多脂褐素沉积；出现胞核固缩，核膜断裂，线粒体空泡化，有脂褐素沉积；神经毡呈空泡化，神经丝溶解消失；核基轻度空化，胞质内可见线粒体，粗面内质网及脂褐素。SAMR1组神经元胞膜完整，染色质分布均匀，细胞器清晰可见，排列有序，细胞核呈圆形或椭圆形，核仁清楚，单个或两个；神经毡超微结构正常。低、中、高浓度MT3组均可见神经元轻度空泡化改变，胞质内都可见线粒体和粗面内质网稍肿胀，脂褐素沉积；神经毡内空泡化减少，神经丝较空白对照组增多；高浓度MT3组可见接近正常神经元，有少量脂褐素，神经毡、神经丝较空白对照组增多。海马CA1区超微结构受损逐渐减轻，高浓度MT3组最接近于SAMR1组，但仍未达到正常(图2)。

图1 各组海马CA1区锥体细胞排列比较(HE，×400)

图2 各组海马CA1区神经元透射电镜超微结构

3 讨 论

AD主要病理变化包括神经元缺失，老年斑形成，神经原纤维缠结及神经胶质细胞增生。海马结构在学习、记忆等高级神经活动中起重要作用。SAMP8是由日本京都大学Takeda教授开发，以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，成为研究老化和学习记忆障碍的理想动物模型〔8，9〕。本实验说明SAMP8学习记忆能力下降与海马结构神经元减少、变性和凋亡有关。SAMP8经MT3治疗能减轻海马神经元的损伤，对神经元起到保护作用。MT3只存在于中枢神经系统，对其生物学功能的认识，目前概括起来包括以下几个方面：①对铜、锌等金属的隔离与分散作用；②调控锌金属蛋白的生物合成及活性；③保护细胞免受自由基伤害；④特定情况下对神经元细胞生长的抑制作用。本实验结果证实SAMP8学习记忆能力下降有其海马结构的组织形态学基础，MT3能通过对海马神经元的保护作用而起到改善认知功能。目前MT3对AD的保护作用机制尚未清楚。

4 参考文献

1Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse (SAM) as an animal model of senile dementia：pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998；78：399-404.

2Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999；20：111-5.

3Han S，Rudd JA，Hu ZY，etal.Fang M.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010；120(9)：602-8.

4Fernández-Gómez FJ，Muoz-Delgado E，Montenegro MF，etal. Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010；88(1)：155-66.

5Takeda T.Senescence-accelerated mouse (SAM)：a biogerontological resource in aging research〔J〕.Neurobiol Aging，1999；20(2)：105-10.

6Uchida Y，Takio K，Titani K.The growth inhibitory factor that is deficient in Alzhemler’s disease is a 68 amino acid metallothionein-like protein〔J〕.Neuron，1991；7(2)：337-47.

7Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，etal.Metallothionein is reduced in Alzheimer’s disease〔J〕.Brain Res，2001；894：37-45.

8Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM) as an animal model of senile dementia：pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998；78：399-404.

9刘一凡，石学敏，韩景献，等.快速老化脑萎缩模型小鼠脑抗氧化酶活性增龄性变化的研究〔J〕.中国老年学杂志，2003；23：462-3.