罗格列酮对帕金森病模型小鼠炎症反应和细胞凋亡的影响

张 田 魏子峰 秦丽娟 周洪霞 张宇新

(河北联合大学基础医学院生理学教研室，河北 唐山 063000)

目前，对帕金森病(PD)的治疗仍然采用多巴胺(DA)替代疗法，已知的药物只能起到改善症状的作用，不能延缓疾病的进程和DA能神经元退变，而且长期服用会产生严重的副作用，因此急需找到有效的治疗药物。近年研究显示，炎症反应和细胞凋亡在PD病理过程中可能起了重要作用〔1，2〕。罗格列酮是一种常用的治疗糖尿病药物，文献报道，在神经系统变性疾病中对神经元有保护作用〔3〕。本实验以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)制备小鼠模型，探讨罗格列酮能否减少炎症因子环氧合酶(COX)-2、前列腺素E2(PGE2)和凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表达，从而对DA能神经元产生保护作用，以期为PD寻找新的可能治疗途径。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 雄性健康C57BL/6N 小鼠45只，12～14 周龄，体质量 25～30 g，清洁级，购于北京维通利华公司，自由进食，饮水，室温(25±2)℃，单笼喂养。MPTP(Sigma，USA)、兔抗人COX-2多克隆抗体(福州迈新公司)、兔抗鼠caspase-3多克隆抗体(福州迈新公司)、兔抗鼠PGE2单克隆抗体(Cayman，USA)、预染蛋白Marker(天津灏洋生物公司)、大鼠抗酪酸羟化酶(TH)单克隆抗体(Chemicon，USA)、罗格列酮(英国葛兰素史克公司)、UltraSensitive SP超敏试剂盒(福州迈新公司)。

1.2动物分组和模型制备 实验动物随机分为3组，每组15只。模型组：腹腔注射MPTP(25 mg/kg，生理盐水溶解)，1次/d，连续7 d；罗格列酮处理组：在MPTP注射前4 h灌胃给予罗格列酮预处理(4 mg/kg)，1次/d，连续7 d；对照组：注射与模型组等量生理盐水。

1.3组织固定、取材和切片 MPTP第7 次注射后12 h ，每组随机取9只小鼠。腹腔麻醉后，经左心室插管用生理盐水(室温)灌注，再用4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液缓慢灌注固定，迅速切取中脑黑质部位脑块，置于4%多聚甲醛后固定48 h(4℃)，固定好的脑组织经蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，包埋后，石蜡切片机做连续冠状切片，片厚5 μm，4℃保存备用。每组15只小鼠中，随机取另外6只进行免疫印迹分析。小鼠麻醉后，迅速断头取脑，分离中脑黑质部分，置入细胞裂解液中，低温匀浆，4℃震荡30 min后，12 000 r/min，4℃离心15 min，取上清液，-80℃保存备用。

1.4免疫组织化学 免疫组织化学显色采用链霉素亲生物素-过氧化酶连接法(SP)法，步骤如下：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，用三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)(pH 7.4±0.2)洗3次，每次5 min；组织切片进行水浴法抗原修复；降至室温；每张切片加入过氧化氢(25 μl)阻断内源性过氧化物酶；每张切片滴加10%正常山羊血清(25 μl)室温孵育15 min，同一组织相邻切片分别加入兔抗人COX-2多克隆抗体(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗体(1∶300)，兔抗鼠PGE2单克隆抗体(1∶300)，大鼠抗TH单克隆抗体(1∶300)，4℃过夜；加入二抗(生物素标记羊抗兔IgG，1∶150)室温孵育20 min；加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(25 μl)室温孵育20 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。免疫组织化学显色数据，采用CMIAS真彩医学图像自动分析系统进行阳性细胞计数。各组每只动物3张脑片数值相加后取平均值。

1.5免疫印迹 蛋白定量后取4倍体积样品缓冲液，95°C变性10 min。蛋白上样量为每孔30 g，10% SDS-PAGE电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维膜上，依分子量大小切取条带，加入封闭液室温下震荡2 h后，取相应条带分别加入兔抗人COX-2多克隆抗体(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗体(1∶300)，兔抗鼠PGE2单克隆抗体(1∶300)，大鼠抗TH单克隆抗体(1∶400)，4℃过夜。室温孵育1 h后；分别加入二抗(生物素标记羊抗兔IgG，1∶500)室温孵育1 h；加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液室温下孵育0.5 h；DAB显色,扫描蛋白印迹条带，作定量分析。

1.6行为学检测 为了测定各组小鼠行为学功能改变，本实验采用爬杆实验。具体方法是，MPTP注射7 d后，将一根长55 cm直径0.8 cm的木杆上端缠以纱布以防止打滑，作为实验爬杆。测试时将被测小鼠头向上置于木杆顶端。分别记录小鼠转身时间(T-turn)和完全爬到杆底所需要的时间(T-LA)并作统计学分析。每只小鼠测3次取平均值。爬杆时间参数的延长反应小鼠运动功能损害的程度。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件进行单因素方差分析及q检验。

2 结 果

2.1免疫组织化学检测 对照组小鼠中脑黑质区偶见COX-2、PGE2和caspase-3阳性细胞， 模型组COX-2、PGE2和caspase-3阳性细胞数量显著增多；经罗格列酮处理后，COX-2、PGE2和caspase-3阳性细胞较模型组降低(P<0.05)。对照组小鼠黑质区可见大量TH阳性神经元，与对照组比较，模型组TH阳性神经元大量丢失，经罗格列酮处理后，TH阳性神经元丢失程度明显减轻(P<0.05)。见表1。

2.2免疫印迹检测 免疫印迹结果显示，对照组仅有微量COX-2、PGE2和caspase-3表达，模型组COX-2、PGE2和caspase-3表达水平升高(P<0.05)；经罗格列酮处理后，COX-2、PGE2和caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.05)；模型组TH表达较对照组降低，罗格列酮治疗后出现明显升高(P<0.05)。见表2。

表1 各组小鼠中脑黑质COX-2，PGE2，caspase-3和TH阳性细胞数

表2 各组小鼠中脑黑质COX-2，PGE2，caspase-3和TH蛋白表达水平

2.3行为学检测 MPTP注射7 d后，模型组小鼠出现典型PD样症状，表现为竖毛、翘尾、震颤和运动变缓等特征。爬杆试验中，与对照组小鼠比较，出现爬杆能力下降，爬杆所需用时间显著延长。罗格列酮处理后，小鼠运动功能得到一点程度改善，表现为爬杆时间明显缩短(P<0.05)。见表3。

表3 罗格列酮对不同组小鼠爬杆时间的影响

3 讨 论

PD是一种常见于中老年人中枢神经系统退变性疾病，其病理改变主要为中脑黑质区DA能神经元变性坏死，DA合成减少，进而抑制乙酰胆碱的功能降低，两者失衡从而出现“震颤麻痹”。迄今为止，病因及发病机制不详。

研究表明，细胞凋亡是PD发病的重要机制之一〔4〕。caspase-3是细胞凋亡过程的最终执行者，在DA能神经元变性中可能起重要作用〔5〕。COX-2是炎症介质PGE2合成的限速酶，有研究显示，COX-2及其介导的炎症介质PGE2可能参与DA能神经元丢失〔6〕。本实验采用MPTP制备PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天观察了小鼠黑质区COX-2、PGE2和凋亡因子caspase-3的表达及TH神经元丢失情况。免疫组化结果显示，模型组小鼠黑质区TH阳性神经元显著丢失，同时伴有COX-2、PGE2和caspase-3大量表达，而对照组未出现上述变化；免疫印迹检测，结果也显示了同样的趋势。这些现象表明，DA能神经元丢失可能与炎症反应及细胞凋亡存在密切联系。

目前，对PD的治疗仍然是控制症状，左旋多巴是治疗PD的首选药物，但它并不能阻止病程进展，长期应用会使疾病恶化。文献报道，罗格列酮能减少脊髓损伤后神经细胞凋亡,促进神经功能的恢复〔7〕，在亨廷顿疾病中，罗格列酮可防止线粒体功能障碍，对神经元起到保护作用〔8〕。最近研究发现，在MPTP所致PD慢性动物模型中，罗格列酮可以通过降低小胶质细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ表达水平从而抑制炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)-α产生〔9〕。由于MPTP选择性破坏黑质DA能神经元导致黑质纹状体神经末梢DA递质大量减少，从而出现PD样症状。

综上，在本实验条件下，MPTP可诱导模型动物中脑黑质COX-2、PGE2和caspase-3的高表达，最终导致DA能神经元变性丢失；罗格列酮可抑制COX-2、PGE2和caspase-3表达，使DA能神经元变性丢失现象有所减轻，从而发挥一定的神经保护作用。

4 参考文献

1Orr CF，Rowe DB，Mizuno Y,etal.A possible role for humoral immunity in the pathogenesis of Parkinson′s disease〔J〕.Brain，2005；128(11):2665-74.

2Mori T，Hayashi T，Su TP,etal.Compromising sigma-1 receptors at the ER renders cytotoxicity to physiologically relevant concentrations of dopamine in a NF-κB/Bcl-2-dependent mechanism：potential relevance to Parkinson′s disease〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2012 ；341(3):663-71.

3Escribano L，Simón AM，Gimeno E,etal.Rosiglitazone rescues memory impairment in Alzheimer′s transgenic mice：mechanisms involving a reduced amyloid and tau pathology〔J〕.Neuropsychopharmacology，2010；35(7):1593-604.

4Rodríguez-Blanco J，Martín V，García-Santos G,etal.Cooperative action of JNK and AKT/mTOR in 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced autophagy of neuronal PC12 cells〔J〕.J Neurosci Res，2012；90(9):1850-60.

5Lee JE，Kang JS，Ki YW,etal.Fluazinam targets mitochondrial complex I to induce reactive oxygen species-dependent cytotoxicity in SH-SY5Y cells〔J〕.Neurochem Int，2012； 60(8):773-81.

6Wang Q，Zheng H，Zhang ZF,etal.Ginsenoside Rg1 modulates COX-2 expression in the substantia nigra of mice with MPTP-induced Parkinson’s disease through the P38 signaling pathway〔J〕.J South Med Univ，2008； 28(9)：1594-8.

7张 钦,吴继彬,黄 晨,等.罗格列酮对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响〔J〕.山东医药,2010；50(22):35-6.

8Quintanilla R A，Jin YN，Fuenzalida K,etal.Rosiglitazone treatment prevents mitochondrial dysfunction in mutant huntingtin-expressing cells - Possible role of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR gamma) in the pathogenesis of Huntington disease〔J〕.J Biol Chem，2008；283(37):25628-37.

9Carta AR，Frau L，Pisanu A,etal.Rosiglitazone decreases peroxisome proliferator receptor-gamma levels in microglia and inhibits TNF-α production：new evidences on neuroprotection in a progressive Parkinson′s disease model〔J〕.Neuroscience，2011；194(2):250-61.