转录因子SNAI1与卵巢癌组织恶性表型之间的关系

帅智峰 刘 婷 于秀文 温秋婷 王玉楼

(齐齐哈尔医学院病理学系，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

卵巢癌浸润转移是治疗失败和患者死亡的重要原因，迄今还没有满意的治疗方法。锌指蛋白SNAI1是胚胎发育中促进中胚层和神经嵴形成的非常重要的转录因子。SNAI1通过抑制E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达诱导上皮间质转化(EMT)的发生，导致癌细胞丧失上皮特性，富于侵袭和转移特性〔1〕。目前尚无关于SNAI1在卵巢肿瘤中表达的比较研究。本研究用免疫组织化学检测83例卵巢囊腺瘤、不同分化程度的卵巢癌组织中SNAI1 和E-cadherin的表达情况，探讨SNAI1在卵巢癌中表达的意义。

1 材料和方法

1.1标本来源 收集齐齐哈尔医学院病理诊断中心2008年9月1日至2011年3月1日存档的卵巢上皮性肿瘤组织标本，共83例。全部病例由病理专家复诊并依据最新《WHO肿瘤病理学和遗传学分类》进行病理组织学分类及分期。其中卵巢囊腺瘤33例，高分化卵巢癌35例，低分化卵巢癌15例。患者年龄23～ 68岁，中位年龄49岁，术前均未接受化疗和放疗。所有组织10% 福尔马林固定，常规石蜡包埋，3 μm厚切片， 免疫组织化学二步法进行检测。

1.2试剂 SP法检测试剂盒和E-cadherin 鼠抗人多克隆抗体购自北京中杉公司；SNAI1兔抗人多克隆抗体购自美国U S Biological公司；人卵巢癌细胞系HO8910购自中科院上海生物科学研究所细胞库；重组腺病毒表达载体pAdEasy-SNAⅡ由我校药物研究所协助构建。

1.3SP法检测SNAI1、E-cadherin的表达 免疫组织化学方法按试剂盒说明书操作。SNAI1抗体的工作浓度为1∶200，E-cadherin抗体的工作浓度时1∶50，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液抗原修复，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，PBS取代一抗作阴性对照。

1.4结果判断标准

1.4.1SNAI1 细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。①强度分数标准：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②随机选择10个高倍视野，每个视野计算100个肿瘤细胞，共计数1 000个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率：1%～<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～<75%为3分，≥75%为4分。两项得分相乘，4～7分为“+”，8～11分为“”，满12分为“”，“+～”为阳性表达。

1.4.2E-cadherin 在细胞膜及少许细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。按着色强度及范围分为4级：阳性细胞数0～10%为“-”，阳性细胞数>10%～ 50%为“+”,阳性细胞数>50%～ 90% 为“”,阳性细胞数>90%为“”。

1.5重组腺病毒表达载体pAdEasy-SNAI1 感染HO8910人卵巢癌细胞 HO8910细胞接种到6孔板培养至80%～90%融合，更换新鲜培养基进行重组腺病毒转染。实验组每孔加入10 μl pAdEasy-SNAI1病毒浓缩液，对照组加入10 μl空载腺病毒pAdEasy-GFP 浓缩液。转染72 h后,检测目的蛋白表达水平，确认转染效率。

1.6Western印迹法检测HO8910细胞SNAI1蛋白，上皮性标记物E-cadherin和间叶标记物Vimentin的表达 细胞裂解缓冲液裂解HO8910细胞提取总蛋白，取等量蛋白质进行凝胶电泳分离，分离后的蛋白质转移至PVDF膜，并以5%脱脂奶粉封闭2 h。加入1∶500 稀释兔抗人SNAI1蛋白多克隆抗体、小鼠抗人E-cadherin单克隆抗体及1∶300 稀释小鼠抗人Vimentin单克隆抗体、小鼠抗人β-actin 单克隆抗体。4℃过夜后,加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗(1∶2 000 稀释)，37℃ 孵育2 h，PBS液洗膜后暗室内加Western Blue显影。

1.7划痕实验检测HO8910细胞的运动能力 将转染目的基因后的HO8910细胞接种到6 孔板中，待细胞单层铺满后，10 μl移液器枪头在6 孔板中划线，划痕面积约为10 mm×1 mm，无菌PBS洗去细胞碎屑，更换培养基继续培养，分时段观察，于0、12、24、48 h在倒置显微镜下照相。

1.8统计学方法 采用SPSS13.0软件进行Kruskal-Wallis Test和Spearman相关分析。

2 结 果

2.1SNAI1 表达情况 免疫组化结果显示，SNAI1表达主要定位在细胞核内(图1)，呈弥漫分布。SNAI1在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌及低分化卵巢癌组织的表达明显不同(χ2=50.496，P=0.000;χ2=15.051，P=0.014)，以低分化卵巢癌中的表达最强。见表1。

2.2E-cadherin 表达情况 E-cadherin在胞膜上呈均质、连续线状表达，E-cadherin在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌、低分化卵巢癌组织的表达明显不同(χ2=32.949，P=0.000;χ2=14.489，P=0.029)，见表1，图2。

表1 SNAI1、E-cadherin在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌和低分化卵巢癌中的表达(n=83)

卵巢囊腺癌 高分化卵巢癌 低分化卵巢癌

卵巢囊腺癌 高分化 卵巢组织

2.3SNAI1、E-cadherin相关性分析 在卵巢囊腺瘤、高分化卵巢癌及低分化卵巢癌组织的中的SNAI1与E-cadherin的表达呈显著负相关关系(r=-0.342,P=0.000)。

2.4过表达SNAI1对HO8910细胞上皮/间叶标记物表达的影响 Western印迹法检测蛋白水平：以兔抗人SNAI1蛋白多克隆抗体作为检测抗体，检测SNAI1蛋白在HO8910细胞中的表达，实验组SNAI1蛋白表达水平显著增强,明显高于对照组(P<0.01),实验组E-cadherin较对照组表达水平显著降低，Vimentin表达水平增高见图3，表2。

表2 SNAI1、E-cadherin、Vimentin在HO8910细胞中的表达情况

图3 Western印迹法检测SNAI1、E-cadherin、Vimentin在HO8910细胞中的表达

2.5过表达SNAI1对HO8910细胞运动能力的影响 细胞划痕后每12 h倒置显微镜下进行1次观察照相，各时间点转染pAdEasy-SNAI1的HO8910细胞划痕愈合速度均快于对照组,实验组细胞运动能力更强,运动速度更快。见图4。

A对照组；B实验组

3 讨 论

SNAI1是锌指转录因子家族成员之一，属于转录抑制因子超家族，它受到多种信号通路的调控，是参与EMT调控的重要转录因子。SNAI1诱导的EMT过程在胚胎发育、创伤愈合、细胞分化、细胞迁移、肿瘤转移等生理、病理过程中起重要作用〔2〕。目前，普遍认为SNAI1通过诱导EMT过程促进肿瘤细胞侵袭和转移，在肿瘤转移的初期阶段发挥重要作用。

SNAI1是snail超家族中最早被发现的，该家族由一个高度保守的羧基末端及一个高度可变的氨基末端构成，其家族成员在结构上的差异主要表现在中间P-S富集区域。同时snail的二级结构包括两个β-折叠、一个α-螺旋和一个DNA连接凹槽，DNA连接凹槽可特异性的与含6个核心碱基(CAGGTG/CACCTG)的结合位点结合，该结合位点被称为E-box〔3〕。Larue等〔4〕描述，在中胚层与神经嵴的前体中，SNAI1通过下调E-cadherin而触发上皮细胞向间充质细胞的转变，E-cadherin是负责细胞上皮表型如细胞极性、细胞和基质的黏附能力的主要成分。SNAI1通过与E-cadherin启动子区域的E-box结合，直接抑制E-cadherin表达，诱导EMT发生。

Blanco等〔5〕报道乳腺癌组织中SNAI1表达与肿瘤病理分级和淋巴结转移相关。类似的报道还见于对胰腺癌和结直肠癌和肝癌的研究中〔6～8〕。本研究免疫组化结果提示通过检测卵巢癌的SNAI1水平，可以作为卵巢癌恶性程度和估计预后的指标。

SNAI1通过直接抑制E-cadherin的表达促进EMT的发生。发生EMT的细胞主要表现为细胞极性的丧失、细胞变梭、伸出丝状伪足并获得侵袭运动能力；在分子生物学方面则表现为上皮标志物缺失或减弱，如E-cadherin，而获得间质标志物，如Vimentin的表达增加〔9，10〕。E-cadherin 是细胞黏附分子钙黏蛋白家族中的重要成员，广泛分布于上皮细胞中，E-cadherin是负责细胞上皮表型如细胞极性、细胞和基质的黏附能力的主要成分。目前认为E-cadherin 表达丢失是EMT 最显著特征〔11〕。

本研究证实转录因子SNAI1在促进卵巢癌侵袭转移的病理生理过程中发挥了重要的作用，SNAI1有可能成为卵巢癌治疗的有效靶点。

4 参考文献

1Olmeda D,Moreno-Bueno G,Flores JM,etal.SNAI1 is required for tumor growth and lymph node metastasis of human breast carcinoma MDA-MB-231 cells 〔J〕.Cancer Res,2007；67(24):11721-31.

2Micalizzi DS,Ford HL.Epithelial-mesenchymal transition in development and cancer〔J〕.Future Oncol，2009；5(8):1129-43.

3Ikenouchi J,Matsuda M,Furuse M,etal.Regulation of tight junctions during the epithelium-mesenchyme transition:direct repression of the gene expression of claudins/occludin by Snail〔J〕.J Cell Sci,2003；116(Pt 10):1959-67.

4Larue L,Bellcosa A.Epithelial-mesenchymal transition in development and cancer:role of phosphatidylinositol 3’kinase/AKT pathways〔J〕.Oncogene,2005；24(50):7443-54.

5Blanco MJ,Moreno-Bueno G,Sarrio D,etal.Correlation of Snail expression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas〔J〕.Oncogene,2002；21(20):3241-6.

6Yin T,Wang CY,Liu T,etal.Expression of Snail and E-cadherin in pancreatic carcinoma and clinical significance thereof〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2006；86(40):2821-5.

7Miyoshi A,Kitajima Y,Kido S,etal.Snail accelerates cancer invasion by upregulating MMP expression and is associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2005；92(2)：252-8.

8Liu YN,Lee WW,Wang CY,etal.Regulatory mechanisms controlling human E-cadherin gene expression〔J〕.Oncogene,2005；24(56):8277-90.

9Ahmed S，Nawshad A.Complexity in interpretation of embryonic epithelial-mesenchymal transition in response to transforming growth factor-beta signaling〔J〕.Cells Tissues Organs，2007；185(1-3):131-45.

10Zeisberg M,Neilson EG.Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions〔J〕.J Clin Invest,2009；119(6):1429-37.

11Kang Y,Massague J.Epithelial-mesenchymal transitions：twist in development and metastasis〔J〕.Cell，2004；118(3):277-9.