YAP干扰质粒的构建及转染肺腺癌细胞A549的筛选鉴定

韩高扬 赵 松 党丽峰 齐 宇 杨 洋 刘东雷 张春敭 吴 恺

(郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052)

Hippo信号转导通路是高度保守的负反馈调节通路，YAP基因作为人Hippo通路的主要效应因子，可以引起下游转录因子cyclinE和DIAP1等表达增加，促进增殖及抑制凋亡作用，从而完成对器官大小、组织再生和干细胞自我更新方面的控制〔1～3〕。近年来，Hippo通路与肿瘤间的联系引起了人们的重视，多项研究证实了YAP在多种肿瘤中的表达明显上调〔4〕。本研究设计和构建了针对靶向YAP基因的小发卡RNA(shRNA)，建立稳定转染并低表达YAP基因的肺癌A549细胞系，为以后特异性了解Hippo信号传导通路及YAP基因在肺癌细胞恶性增殖及侵袭能力中所发挥的作用，并进一步探讨其作用机制提供依据，以期为肺癌的综合治疗及Hippo信号通路的调节提供新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1材料 人肺癌细胞A549由河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室冻存。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含EDTA胰蛋白酶消化液购自Solarbio公司，载体质粒和大肠杆菌购自吉码生物公司。各种限制性内切酶、DNA连接酶及荧光定量PCR引物和内参引物均购自生工生物有限公司。TRIZOL、逆转录试剂盒均购自鼎国生物有限公司。荧光试剂盒购自BMI生物公司。抗YAP抗体购自Santa Cruz，二抗购自博奥森生物公司。脂质体购自吉凯基因生物有限公司。

1.2靶向YAP干扰质粒的设计和构建 根据GenBank中人YAP基因的cDNA序列，利用Invitrogen网站提供的软件合成YAP基因的特异性干扰片段，针对靶基因不同的靶点设计4个shRNA，分别为shRNA1～4，同时在上游引物5′端增加Xho I的酶切位点，下游引物5′端增加BamH I的酶切位点。shRNA1正义链：5-GCCATGACTCAGGATG-GAGAATT-3，反义链：5-ATTCTCCATCCTGAGTCATGGC-3；shRNA2正义链：5-CCCAGTTAAATGTTCACCAATT-3，反义链：5-AATTGGTGAACATTTAACT-GGG-3；shRNA3正义链：5-GCCACCAAGCTAGATAAAGAAT-3，反义链：5A-TTCTTTATCTAGCTTG-GTGGC-3；shRNA4正义链为5-CAGGTGATACTATCAA-CCAAAT-3，反义链：5-ATTTGGTTGATAGTATCACCTG-3；阴性对照表达载体NCRNA正义链为5-TTCTCCGAACGT-GTCACGTT-3，反义链：5-AACGTGACACGTTCGGAGAA-3。序列合成后的寡核苷酸双链(ds oligo)，用T4DNA连接酶将双链寡核苷酸与pGPU6-GFP-Neo线性载体定向连接后转化大肠杆菌TOP10，含新霉素的LB琼脂平板筛选，次日挑取平板上阳性单克隆菌并扩增培养，进行测序分析。根据测序结果挑取阳性单克隆菌，接入培养基中，摇床24 h，用质粒提取试剂盒提取经扩增筛选正确的重组质粒，取构建的质粒再次行PCR扩增测序。

1.3shRNA转染细胞 人肺癌细胞A549培养于含10%胎牛血清的1640中，转染前24 h，用胰蛋白酶消化肿瘤细胞，接种于6孔板中(每孔约1.5×105个细胞)，转染前6 h换无血清无抗生素的培养基，37℃，5%CO2环境中培养，在生长到40%～70%时进行转染。溶液A：1.2 μg shRNA溶于含250 μl无血清的培养基中，溶液B：4.5 μl脂质体溶于250 μl无血清培养基中，室温下孵育5 min。将A，B溶液混合，室温下静置20 min后，混合A、B两溶液后加入1.5 ml无血清培养基，将混合后的溶液加入到漂洗过的细胞上，37℃，5%CO2环境中培养6 h，换成含血清含抗生素的培养基继续培养。24 h观察荧光，确定转染效率，48 h后提取mRNA和总蛋白。

1.4RT-PCR检测 采用TRIzol法分别抽提6种细胞的总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。进一步利用RT-PCR检测YAP基因低表达程度。YAP引物序列：正义GCTCTTCCTTGTCCATTGCT，反义CATCATCCAAACAGGCTC-AC；以管家基因β-actin作为内参，引物序列：正义AGCGAGCATCCC-CCAAAGTT，反义GGGCACGAAGGCTCATCATT。反应体系：cDNA 2 μl，上游引物、下游引物各1 μl，SYBR solution混合物12.5 μl，加ddH2O至25 μl。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s。每组设3个复孔，以β-actin作为参照，计算Ct均值，应用相对定量法ΔΔCt进行定量分析。

1.5Western印迹检测 48 h后提取肿瘤细胞中的蛋白，采用紫外分光光度计测蛋白浓度，配置分离胶，水封，加浓缩胶，第一孔加Marker，第二孔加用shRNA1转染肿瘤细胞的蛋白，第三孔加用shRNA2转染肿瘤细胞的蛋白，第四孔加用shRNA3转染肿瘤细胞的蛋白，第五孔加用shRNA4转染肿瘤细胞的蛋白，第六孔加NCshRNA转染的肿瘤细胞蛋白，第七孔加未进行转染的肿瘤细胞的蛋白，跑胶，电泳转膜，封闭，加一抗(1∶200)4℃过夜孵育，TBST洗膜三遍，加稀释的二抗(1∶2 000)孵育，TBST洗涤三遍，加荧光显影剂(注意避光，扫描图片)。

2 结 果

2.1转染效率的观察 细胞转染后48 h，在倒置荧光显微镜下，shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA组均可观察到荧光(图1)，提示构建的干扰载体均可有效表达。

图1 A549细胞质粒转染48 h后转染效率

2.2RT-PCR结果 shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4组相对于空白对照组，YAP mRNA表达均有所下调，其中shRNA2组和shRAN3组表达下调最明显，shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4，NCRNA组和空白对照组2-ΔΔct值分别为2.775，0.498，0.432，2.834，3.289，3.320。shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4组相对与空白对照组分别下降了17%，85%，87%，12%。shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNA4组与NCRNA组和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，NCRNA组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3Western印迹结果 shRNA1组，shRNA2组，shRNA3组，shRNA4，NCRNA组，空白对照组的蛋白相对灰度值分别为0.690，0.411，0.354，0.688，0.699，0.712，shRNA3组表达蛋白最低，其中shRNA2组和shRNA3组与shRNA1组、shRNA4组、shRNA5组和空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，shRNA1组、shRNA4组、shRNA5组和空白对照组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

shRNA1 shRNA2 shRNA3 shRNA4 NCRNA 空白对照组

3 讨 论

在Hippo通路中，Hpo、Sav、Wts、Mats都是抑癌基因，只有Yki是癌基因；同样，在人体中，Hippo通路也是细胞增殖的负调控通路，而YAP是磷酸化后抑制的关键转录激活因子。近来有研究证明YAP是一个癌基因，作为Hippo通路的下游信号分子，YAP具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，导致细胞接触性抑制丧失及促进细胞恶性分化的作用。已经有研究结果支持这一观点，如YAP mRNA及YAP蛋白在肝癌、胰腺癌及结肠癌组织中表达明显上调〔5〕。但是，YAP作为促癌因子促进肿瘤发生的同时，在某些情况下还具有促进凋亡的作用。在DNA损伤时，PML募集YAP及p73蛋白到核内作为转录辅助激活因子，YAP增强p73相关凋亡基因的转录〔6〕。此外，有人在乳腺癌的研究中发现，YAP在乳腺癌中的表达明显下调甚至缺失，而且YAP缺失的乳腺癌细胞表现出了更强的浸润及转移能力〔7〕。因此，有研究者认为YAP作为癌基因的角色需要重新定位。

肺癌是世界上死亡率最高的癌症，每年约120万人死于肺癌。尽管在手术和放化疗方面取得了长足的进步，但是肺癌的5年生存率仍然小于15%。在确诊的肺癌患者中，超过80%的病人是非小细胞肺癌，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等〔8，9〕。因此，本研究选取肺癌细胞作为研究的载体。

就目前国内外研究所见，鲜有Hippo通路及YAP基因在肺癌细胞中表达及作用的报道。本研究拟分析YAP基因在肺癌细胞中的表达水平，针对YAP基因设计靶向性的shRNA，特异性的干扰YAP基因的表达，为进一步特异性的了解Hippo信号传导通路在细胞恶性增殖及侵袭能力中的作用以及其在非小细胞肺癌发生发展过程中所具有的作用及机制做铺垫；并为进一步探索其调控机制奠定基础，为非小细胞肺癌提供新的治疗靶点。

4 参考文献

1Oh H，Irvine KD.In vivo regulation of Yorkie phosphorylation and localization〔J〕.Development，2008;135(6):1081-8.

2Bin Z，Karen-Liang G.The Hippo pathway in organ size control，tissue regeneration and stem cell self-renewal〔J〕.Nat Cell Biol,2011;13(8):877-83.

3Camargo FD，Gokhale S，Johnnidis JB，etal.YAP1 increases organ size and expands undifferentiated progenitor cells〔J〕.Curr Biol,2007;17(13):2054-60.

4Zhao ，Li L，Lei Q，etal.The Hippo-YAP pathway in organ size control and tumorigenesis: an updated version〔J〕.Genes Dev,2010;24(9):862-74.

5Steinhardt AA，Gayyed MF，Klein AP，etal.Expression of Yes-associated protein in common solid tumors〔J〕.Hum Pathol，2008;39(11):1582-9.

6Strano S，Monti O，Pediconi N，etal.The transcriptional coactivator yes-associated protein drives p73 gene-target specificity in response to DNA damage〔J〕.Mol Cell,2005;18(3):447-59.

7Yuan M，Tomlinson V，Lara R，etal.Yes-associated protein(YAP) functions as a tumor suppressor in breast〔J〕.Cell Death Differ，2008;15(11):1752-9.

8Ramnath N，Dilling TJ，Harris LJ.Treatment of stage Ⅲ non-small cell lung cancer: diagnosis and management of lung cancer，3rd ed: American College of Chest Physicians evidence-based clinical practice guidelines〔J〕.Chest,2013;143(5):e314S-e340S.

9Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2012;62(1):10-29.