MTFHR基因多态性对脑出血的影响及对手术风险的预警

李 玻 黄 达

(三亚市人民医院神经外科，海南 三亚 572000)

目前中西方人群引起脑出血的原因发生了变化，西方国家脑出血的病因主要是淀粉样脑血管病(CAA)，而在我国，高血压仍然是引发脑出血的重要因素〔1〕。近些年的研究证明血浆同型半胱氨酸(Hcy)升高是心血管疾病的危险因素之一，可调节血管内皮细胞、血小板等的活性，引发动脉粥样硬化及脑梗死〔2,3〕。甲硫氨酸合成酶(MTHFR)是催化Hcy转化为甲硫氨酸的主要酶类，对控制Hcy的浓度起着关键作用〔4〕。大多数脑出血患者往往通过手术的方式取出血肿，而手术时机成为患者预后的重要因素，如果能找到相应的参考依据选择合理的手术时机，无疑将为脑出血患者带来福音。本研究拟探讨MTHFR的遗传多态性、血浆Hcy浓度与脑出血患者凝血情况间的关系，为脑出血手术时机的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1对象 根据1995年全国第四次脑血管病会议制定的脑出血诊断标准并结合头颅CT结果选择2010年9月至2013年2月在我院住院治疗的脑出血患者170例作为研究对象。所有入选患者符合以下特点：有高血压病史，病程4～16年，根据血肿大小计算出血量在30～80 ml，手术时间均在病发2～3 h，排除既往脑出血病史、严重感染、肝肾等器质性疾病，排除一个月内服用维生素B12、叶酸、叶酸拮抗剂等影响Hcy浓度的药物。

根据病发24 h手术时观察的凝血情况将两组患者归为实验组和对照组。实验组为凝血状况良好的患者共87例，男45例，年龄40～65岁，平均62.7岁，女42例，年龄41～63岁，平均59.2 岁；对照组为凝血状况较差的患者共83例，男45例，年龄39～66岁，平均61.8岁，女38例，年龄42～68岁，平均61.3岁。两组患者的年龄、性别、病程等无显著差异，具有可比性。

1.2方法

1.2.1Hcy检测方法 受试者术后12 h采集EDTA抗凝血3 ml，收集血浆并于2 h内利用全自动生化仪完成对血浆Hcy的检测，测定值高于15 μmol/L 判定为高Hcy血症。

1.2.2基因多态性检测方法 ①基因扩增：提取白细胞基因组DNA，设计引物P1 gcgaggccggggtcgccggagggagatcc和P2ccgtccaggcagggagccaaagcagtct，扩增含有rs13306561的长度为231 bp的片段。设计引物P3 tgaaggagaaggtgtctggggga和P4aggaccgtgcggtgagagtg，扩增含有C667T的长度为246 bp的DNA片段。用PCR的方法对片段进行扩增，扩增体系：模板DNA 0.2 g,引物各0.1 pmol/L，4种dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康为世纪)1 U，体积为50 μl。反应经历33个循环，条件：94℃变性30 s，65℃退火30 s,72℃延伸40 s。②基因分型：将PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司，利用Snapshot的方法进行基因分型。

1.3统计学分析方法 利用SPSS18.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1组间Hcy检测结果分析 实验组中高Hcy患者68例(78.16%)，对照组57例(68.68%)，组间无显著差异(χ2=1.96，P=0.16)。

2.2基因型检测结果 C667T和rs13306561两个多态位点均可检测出CC、CT、TT三种基因型。C667T位点CC、CT、TT三个基因型在实验组中的检出频率为45.98%(40例)、28.74%(25例)、25.29%(22例)，在对照组中的检出频率为65.01%(54例)、22.89%(19例)、12.05%(10例)。统计学分析显示三种基因型在组间具有显著差异(χ2=7.31，P<0.05)。将TT基因型与其他基因型进行差异性比对，结果也显示具有统计学意义，实验组 vs 对照组：65例(74.72%)vs 73例(87.90%)(χ2=4.87，P<0.05)。说明C667T多态位点的TT基因型可能有利于凝血。

rs13306561位点CC、CT、TT三个基因型在实验组中的检出频率为56.3%(49例)、29.88%(26例)、13.79%(12例)，在对照组中的检出频率为72.29%(60例)、19.28%(16例)、8.43%(7例)。统计学分析显示三种基因型的组间差异不显著(χ2=4.71，P=0.09)。将CC基因型与其他基因型进行差异性比对，结果显示具有统计学意义实验组vs对照组：38例(43.67%) vs 23例(27.71%，χ2=4.72，P=0.03)。说明rs13306561多态位点的CC基因型可能有利于凝血。见表1。

2.3单倍型检测结果 综合分析C667T和rs13306561两个多态位点的发生情况，可出现9种单倍型，其中CC/CC、CT/CT单倍型的分布频率具有组间差异(P<0.05)。见表1。

表1 C667T/rs13306561单倍型比较结果〔n(%)〕

3 讨 论

对脑出血患者而言，目前存在两种治疗策略：(1)针对出血量低于30 ml的患者进行保守性溶血治疗，(2)对出血量大于30 ml的患者进行手术治疗。在手术治疗的过程中存在着明显的矛盾：施行手术时间距离病发时间越久，病人术中出血及术后二次出血的可能性越小，但血肿对患者造成的神经损伤也就越严重。即使是在距离病发相同时间内施行手术的患者，也存在着很大的差异。患者形成血肿的时间与其凝血能力密切相关，凝血能力越强，患者形成血肿的时间越短，就可以选择早期手术，改善患者的预后；反之，则容易使患者的手术时间推迟，进而加重患者的神经功能损害，恶化患者的预后。

血浆Hcy水平升高是动脉硬化、动脉血栓的重要的独立危险因素。近些年的研究发现，Hcy以及相应的衍生物可增加血小板凝血恶烷的产生，从而影响血小板的凝集。此外，Hcy还可以产生过氧化氢，干扰凝血酶和肝素的结合，并且直接激活X等凝血因子，从而促进凝血过程。当脑出血发生时，血浆中Hcy水平可能成为影响患者应激状态下凝血能力的重要因素。然而，在本次的研究中，我们发现手术过程中凝血能力较好的实验组和凝血较差的对照组之间Hcy水平没有统计学差异。分析其原因，可能是由于本次取样时间是在患者术后12 h，距离病发时间已经超过了15 h，未能反映发病过程中血肿形成及手术过程中的实时血浆Hcy水平。

MTHFR是催化Hcy代谢的关键酶，也是血浆中Hcy水平的关键决定因素。本次研究结果显示MTHFR基因的C667T和rs13306561两个多态位点均可检测出CC、CT、TT三种基因型，并且MTHFR C667T位点突变(基因型TT)可能与凝血能力密切相关，rs13306561位点的CC基因型可能与脑出血倾向密切相关。此两个多态位点可形成9种单倍型，其中单倍型CC/CC在实验组中明显低于对照组，说明该单倍型可能不利于早期凝血的进行。根据以上结果，我们认为C667T多态性位点的突变基因型TT可能具有促进凝血的作用，因而对于携带有此类基因型的患者可选择早期手术，而rs13306561位点的CC基因型患者则应该选择推迟手术时间。然而由于本次研究所采集的样本量有限，本结论尚有待于在增大样本群的基础上进行深入的验证。

4 参考文献

1Mirsen T．Acute treatment of hypertensive intracerebral hemorrhage〔J〕．Curr Treat Options Neurol，2010;12(6)：504．

2杨 爽，刘春淋，李 黎,等.血浆同行半胱氨酸与高血压及脑卒中的相关性〔J〕.四川医学，2013;3(3)：436-7.

3Sepulveda Sanchez JM，Matia Frances R，Malinez．Salio A，etal．Homocysteine and eerebrovasculardisease〔J〕．Rev Neurol，2004;38(4)：347-58.

4张松涛，郑 勇.同型半胱氨酸在心脑血管疾病中的临床意义〔J〕.检验医学与临床，2013;10(5)：582-3.

5闫秋月，张苏明.脑出血诊治的研究现状与新策略探索〔J〕.内科危急重症杂志,2013;19(2):79-81.