芹菜素通过下调MDR-1/P-gp表达逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/5FU多药耐药性的作用及机制

邢海军 崔海燕 赵建虎

(张家口市宣化区医院,河北 张家口 075000)

老年结肠癌在其诊断治疗方面有其特有的特点，如症状隐匿、早期就诊少、手术耐受性差、化学治疗尤为重要等，但在化疗过程中产生多药耐药是临床化疗成功的主要障碍，因此研究结肠癌多药耐药机制及寻找高效逆转剂具有重要意义〔1〕。芹菜素是一种广泛存在于水果和蔬菜中的黄酮类化合物，研究发现具有广泛生物活性，例如抗感染、抗肿瘤及抗氧化等〔2～4〕。但芹菜素对于多药耐药细胞的逆转作用研究尚少见，故本课题以结肠癌耐药细胞株HCT-8/5-FU为研究对象，观察芹菜素对多药耐药人结肠癌细胞(HCT-8/5-FU)P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用以及对HCT-8/5-FU细胞多药耐药耐药性的逆转作用。

1 材料与方法

1.1材料 芹菜素，购于Sigma；CCK-8试剂盒、细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购于碧云天生物技术研究所；鼠抗人P-gp白单克隆抗体购于中杉金桥；总RNA抽提试剂盒、AMV一步法RT-PCR试剂盒购于上海生工有限公司，MDR-1及内参基因引物由上海生工有限公司合成；敏感细胞株HCT-8及其耐药细胞株HCT-8/5-FU购自凯基生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 敏感细胞株HCT-8培养于无Hepes,含10%小牛血清、100 U/ml庆大霉素的RPMI-1640培养液中，置37 ℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中传代培养；相应耐药细胞株HCT-8/5-FU细胞连续培养于含15 000 ng/ml的上述培养液中，以维持其耐药性，实验前3 d换无药物的培养液培养。

1.2.2免疫细胞化学法测定耐药细胞P-gp的表达 实验设0、10 μmol/L芹菜素组，取对数生长期细胞，按每孔2×105个接种于放盖玻片的6孔板中，贴壁后加入不同实验浓度药物，培养24 h后取出盖玻片，多聚甲醛固定10 min，按常规S-P两步法染色。根据细胞染色阳性率分级，无阳性为阴性(-)，阳性率低于25%为弱阳性(+)，阳性率在25%～75%之间为中阳性()，阳性率大于75%为强阳性()。

1.2.3RT-PCR检测耐药细胞MDR-1 mRNA的表达 HCT-8/5-FU耐药细胞经0、10 μmol/L 芹菜素组作用24 h后，用总RNA抽提试剂盒抽提总RNA，以β-actin 作为内参照，按照AMV一步法RT-PCR试剂盒说明书检测耐药细胞内MMDR-1 mRNA的表达情况，MDR-1上游引物：5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3'，下游引物：5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'，扩增产物296 bp；β-actin上游引物：5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3'，下游引物：5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'，扩增产物501 bp 。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。

1.2.4CCK-8法测定无细胞毒作用的芹菜素 取处于对数生长期的HCT-8、HCT-8/5-FU两株细胞经胰酶消化后计数 ,调整细胞悬液密度为1×105/ml，接种于96孔培养板,每孔100 μl，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育 24 h后，加入不同浓度的芹菜素溶液(5,10,20,40，80 μmol/L)，同时设空白对照组(不加细胞仅加培养液)、阴性对照组(不加药物仅加细胞)。每组均设 4个复孔，置于培养箱中再孵育 24 h后每孔加入20 μl CCK-8溶液,继续孵育4 h，以全自动荧光酶仪检测各孔在490 nm处的光吸收值(A)，由空白孔调零后，计算芹菜素对两株细胞的生长抑制率。

1.2.5芹菜素对耐药细胞耐药性逆转作用的检测 实验分为HCT-8/5-FU+5-FU组，HCT-8+5-FU组，HCT-8/5-FU+5-FU+无细胞毒作用的芹菜素组，5-FU终浓度分别为15， 60,240,960，3 840 μg/ml，实验步骤同上，分别计算出各组的IC50值，进而计算出耐药倍数及逆转倍数。

1.2.6荧光显微镜观察细胞凋亡 将耐药细胞株HCT-8/5-FU分为逆转药物组(无细胞毒作用的芹菜素组)、化疗药物组(无细胞毒作用的5-FU组)、联合用药组、阴性对照组(未加任何药物)。取洁净的盖玻片置于6孔板内，种入处于对数生长期的细胞悬液，分别加入上述分组处理因素，培养24 h后，固定、染色，选择激发波长350 nm，发射波长460 nm，在荧光显微镜下观察凋亡细胞情况。正常细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光，凋亡细胞核呈浓染致密的固缩形态,颜色有些发白。细胞凋亡指数计算：每组观察3张片子，每张片子随机选择3个视野，计数100个细胞中凋亡百分率。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行独立样本t检验及χ2检验。

2 结 果

2.1芹菜素抑制P-gp表达 HCT-8/5-FU细胞 P-gp呈强阳性(98.97+2.19)%；经10 μmol/L芹菜素作用24 h后,HCT-8/5-FU细胞 P-gp呈中阳性(59.87+3.25)%； 二者差异显著(P<0.05)。见图1。

2.2芹菜素下调MDR-1 mRNA表达 耐药细胞HCT-8/5-FU高表达MDR-1 mRNA ,经10 μmol/L芹菜素处理后，其MDR1 mRNA 表达水平降低。见图2。

未加芹菜素组 10 μmol/L芹菜素组

1，2：β-actin；3:Marker(100～1 000 bp)； 4:未加芹菜素组；5:10 μmol/L芹菜素组

2.3芹菜素具有细胞毒作用 表1可见，芹菜素对HCT-8/5-FU、HCT-8两细胞株生长抑制作用相近，其在10 μmol/L以下时对两组细胞株均无明显的细胞毒作用，抑制率均在10%以下，芹菜素对两种细胞的IC50值分别为(79.71±8.65)、(81.70±5.24) μmol/L，二者比较差别无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同浓度芹菜素作用HCT-8/5-FU、HCT-8细胞24 h抑制作用±s,%,n=4)

2.4芹菜素具有逆转耐药作用 5-FU对HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的IC50值分别为(830.23±21.79)、(80 242±112.58)、(5 086.1±98.87)μg/ml，耐药细胞株对5-FU的耐药倍数为96.68倍，10 μmol/L芹菜素对耐药细胞的逆转倍数为15.78倍。见表2。

2.5联合用药更能诱导细胞凋亡 HCT-8/5-FU细胞株经10 μmol/L芹菜素，509 μg/ml 5-FU作用24 h后均未见明显凋亡细胞，凋亡指数分别为(9.88±0.58)%、(8.99±0.69)%，二者比较无统计学意义(P>0.05)。经10 μmol/L芹菜素+509 μg/ml 5-FU联合用药后可见明显凋亡，凋亡指数达(40.21±0.95)%，与前两者凋亡指数之和比较具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

阴性对照组

5-FU组

芹菜素组

芹菜素+5-FU组

表2 5-FU作用24 h对HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的抑制作用±s,%，n=4)

3 讨 论

P-gp是最重要的药物外排蛋白，由MDR-1基因编码而成，能与多种被动扩散到细胞内的药物结合，依靠ATP转化能量将到达细胞内的药物泵出，导致细胞内的药物浓度降低〔1,5〕。HCT-8/5-FU是一种人结肠癌多药耐药细胞株，是通过对敏感细胞株HCT-8用5-FU长期反复诱导而成，高表达P-gp和MDR-1 mRNA〔6〕。本实验结果提示，芹菜素在转录和翻译水平抑制了P-gp。此药物可能对多药耐药细胞HCT-8/5-FU多药耐药性具有逆转作用 ,进一步，结果证实，10 μmol/L芹菜素能够提高5-FU细胞毒作用，可使5-FU对HCT-8/5-FU细胞的IC50值从(80 242±112.58)μg/ml降至(5 086.1±98.87)μg/ml，其逆转倍数可高达15.78倍，并且在选择芹菜素逆转耐药浓度(无细胞毒作用的芹菜素浓度，以排除芹菜素本身对耐药细胞的杀伤作用)时发现，芹菜素对耐药及敏感细胞株的IC50无明显差别，这说明与敏感细胞株相比，耐药细胞株对芹菜素没有产生交叉耐药，芹菜素对逆转结肠癌多药耐药有着广泛的应用前景。

近年来还有研究发现，P-gp除了作为药物泵可将到达细胞内的药物泵出，导致细胞内的药物浓度降低外，还可通过改变细胞生存的环境，抑制凋亡相关因子活性，减少质膜上的鞘磷脂等机制抑制肿瘤凋亡，从而使肿瘤细胞产生凋亡抗性〔7,8〕。本文结果提示，当5-FU与芹菜素诱导细胞凋亡情况相似时(凋亡指数均小于10%)，联合用药后可见明显凋亡，凋亡指数增至(40.21±0.95)%，与前两者凋亡指数之和比较具有统计学意义，这说明了芹菜素能够解除了P-gp产生的凋亡抗性，能够诱导更多的耐药细胞凋亡。

综上所述，体外实验证实,芹菜素可在转录和翻译水平抑制P-gp，逆转 HCT-8/5-FU细胞的多药耐药性,解除了P-gp产生的凋亡抗性，诱导更多的耐药细胞凋亡。但关于芹菜素逆转肿瘤多药耐药的体内实验及其药物代谢动力学、药物分析化学的研究还有待进一步完成。

4 参考文献

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