甘草皂苷对单纯疱疹病毒性脑炎小鼠高迁移率族蛋白B1和Toll样受体水平的影响

杨 会 郭远瑾

(荆门市第一人民医院神经内科，湖北 荆门 448000)

单纯疱疹病毒(HSV)性脑炎(HSE)是成年人中最常见的非流行性、散发性病毒性脑炎〔1〕，主要由HSV-1型病毒引起，约占HSE患者总数的94%～96%，HSV-2型病毒主要感染新生儿及儿童。HSE的年发病率约为(2～3)/10万，自然死亡率高达60%～80%，经过有效抗病毒治疗的患者，死亡率仍有20%，同时大多数存活者留有后遗症〔2〕。高迁移率族蛋白(HMG)B1和Toll样受体(TLR)4在HSE鼠脑中的表达量明显升高，提示其在HSE的发病机制中发挥重要作用〔1,2〕。甘草皂苷(Glycyrrhizin)是HMGB1特异性抑制剂，本文探讨Glycyrrhizin对HSE小鼠HMGB1和TLR4水平的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物和病毒液 雄性ICR小鼠，10～16 g，南京医科大学实验动物中心提供，病毒液为HSV-IF株，由华中科技大学同济医学院提供，将HSV-IF株在人用狂犬病纯化疫苗(VERO)细胞中培养48 h，当有50%的VERO细胞变大、变圆或融合性病变时，收集病毒测定该病毒滴度为半数组织培养感染剂量(TCID50)10-5，选择TCID5010-4浓度接种小鼠。

1.2动物分组和模型制作 将小鼠随机分为假手术组、溶剂组、Glycyrrhizin组各20只。模型制作：采用颅内注射法，用微量注射器抽取30 μl病毒悬液接种小鼠，注射部位在小鼠右眼外毗和外耳根连线的中点处垂直进针3 mm，穿过颅骨后有落空感时缓慢推入病毒液，拔出针头，以骨蜡封闭颅骨针孔以防病毒悬液外溢。假手术组给予等量生理盐水注射。造模成功判断标准：小鼠出现体重下降、毛发紊乱、激惹及抽搐发作等，剔除造模失败的小鼠。注射病毒后1 h，Glycyrrhizin组腹腔注射0.5 ml Glycyrrhizin (Sigma公司；50 mg/kg)〔3〕，溶剂组仅腹腔注射等量生理盐水。

1.3标本 在小鼠接种病毒后第6天麻醉后处死，经左心尖注射生理盐水(30 ml)灌注后断头取脑，剖取右侧颞叶组织并置-80℃保存。

1.4Western印迹法检测 取100 mg脑组织，加入1 ml组织蛋白提取试剂(碧云天)，根据说明书步骤进行细胞总蛋白的提取，二辛可酸(BCA)法蛋白定量，取蛋白样品50 μg，电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，β-actin、TLR4和HMGB1抗体用5%牛奶稀释(1∶200)，4℃过夜，洗涤缓冲液(TBST)洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜后，按照发光底物(ECL)说明书，1∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像，Image J软件进行灰度分析。

1.5统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t和χ2检验。

2 结 果

2.1行为学及死亡率 溶剂组和Glycyrrhizin组接种后陆续出现进食减少、体重不增、毛发蓬松、倦怠少动、步态不稳或爬行、抽搐等，3～6 d时症状最明显。 6 d内溶剂组死亡率65%，Glycyrrhizin组死亡率30%，两组死亡率有显著差异(χ2=19.56,P<0.05)。

2.2HMGB1和TLR4的蛋白表达量 与假手术组相比，溶剂组HMGB1和TLR4表达量明显升高；Glycyrrhizin组较溶剂组显著降低(P<0.05)。见表1，图1。

图1 Western印迹检测HMGB1和TLR4的结果

表1 各组HMGB1和TLR4的灰度分析±s)

3 讨 论

HMGB1是一种重要的促炎因子，它是一种在真核细胞内广泛存在的核内非组蛋白，主要发挥稳定核小体的作用，是DNA转录、复制及修复的重要参与者，其在人体内多种器官细胞中均有表达，在胞核和胞质中均有分布〔4〕。当机体遭受病毒感染时，大量组织细胞损伤或者坏死，HMGB1从受损的细胞核迁移至细胞质直至胞外，这对于后续介导的免疫损伤具有重要意义：一方面，可以直接对细胞及组织产生损伤作用，另外一方面在与晚期糖化终末产物受体(RAGE)和TLR4结合后通过活化免疫细胞，使其杀伤靶细胞，清除外来物质或者通过分泌炎性因子产生组织损伤作用。TLR4作为HMGB1的重要配体，它是固有免疫防御系统的重要组成部分，在中枢神经系统的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均有表达，HMGB1与TLR4激活后，通过活化核转录因子(NF)-κB，使炎性细胞因子表达上调〔5〕。

研究表明HSE的发生不仅与病毒复制有直接作用，而且与病毒诱导的宿主免疫反应有密切关系〔6〕。HSE时发生的小胶质细胞的活化、巨噬细胞及T细胞聚集及下游的炎性因子释放在病理损害中发挥重要作用，减少炎症因子的产生可以减轻HSE感染对机体造成的损害，HMGB1和TLR4在HSE动物模型中的表达升高〔7～9〕，但是其具体作用目前尚未有明确报道，Glycyrrhizin是HMGB1的特异性抑制剂，可以抑制HMGB表达发挥抗炎和抗损害作用〔10〕。研究〔11〕发现HSE感染后病变最严重的部位是颞叶，以出血坏死性病灶为特征，本实验表明Glycyrrhizin可以降低小鼠死亡率，其可能机制与抑制鼠脑中HMGB1和TLR4表达相关。

4 参考文献

1赵 琦，陆 晖.单纯疱疹病毒性脑炎的研究进展〔J〕.实用心脑肺血管病杂志，2007；19(6)：1057-8.

2Tan IL，McArthur JC，Venkatesan A，etal.Atypical manifestations and poor outcome of herpes simplex encephalitis in the immunocompromised〔J〕.Neurology，2007；79(21)：2125-32.

3Kim SW，Jin Y，Shin JH，etal.Glycyrrhizic acid affords robust neuroprotection in the postischemic brain via anti-inflammatory effect by inhibiting HMGB1 phosphorylation and secretion〔J〕.Neurobiol Dis，2007；46(1)：147-56.

4Kawai T，Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity：update on Toll-like receptors〔J〕.Nat Immunol，2007；11(5)：373-84.

5Sims GP，Rowe DC，Rietdijk ST，etal.HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer〔J〕.Annu Rev Immunol，2007；28：367-88.

6Nakajima H，Kobayashi M，Pollard RB，etal.Monocyte chemoattractant protein-1 enhances HSV-induced encephalomyelitis by stimulating Th2 responses〔J〕.J Leukoc Biol，2001；70(3)：374-80.

7Sancho-Shimizu V，de Diego RP，Lorenzo L，etal.Herpes simplex encephalitis in children with autosomal recessive and dominant TRIF deficiency〔J〕.J Clin Invest，2007；121(12)：4889-902.

8刘 强，赵春梅，惠 晶，等.单疱病毒性脑炎小鼠中TLR4和IFN-β表达的研究〔J〕.中国免疫学杂志，2007；27(9)：791-5.

9祁 玲，刘 强.HMGB1在小鼠单疱脑炎中的作用探究〔J〕.现代免疫学，2007；12(3)：229-33.

10Mollica L，De Marchis F，Spitaleri A，etal.Glycyrrhizin binds to high-mobility group box 1 protein and inhibits its cytokine activities〔J〕.Chem Biol，2007；14(4)：431-41.

11Jain P,Jain A,Kumar A,etal. Epidemiology and etiology of acute encephalitis syndrome in north India〔J〕.Jpn J Infect Dis,2014;67(3):197-203.