TLR4及相关炎性因子在糖尿病肾病中的表达及临床意义

秦宁宁 王秋月

(中国医科大学附属第一医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病重要的慢性并发症，最终可以引发肾衰竭。目前DN治疗主要是控制血糖和血压，但并不能阻止肾病的发生和发展。免疫和炎症反应在DN的过程中起着重要的作用。Toll样受体4(TLR4)是一种Toll样受体，识别内毒素-脂多糖(LPS)及热休克蛋白(HSP)等内源性配体，激活核因子-κB(NF-κB)启动炎性因子的转录和合成，最终释放大量的炎性因子，参与炎性反应〔1,2〕。本研究拟通过观察DN患者肾小管的病理变化，分析TLR4的表达改变与炎症因子表达的关系，旨在探讨TLR4及炎症因子表达的关系在DN中的作用。

1 资料与方法

1.1研究对象 2011年9月至2013年12月于中国医科大学肾内科住院经临床和肾活检确诊为DN的患者27例。其中男12例，女15例，年龄41～64岁。尿蛋白含量均>500 mg/d。并将DN组患者根据尿蛋白定量分为低蛋白尿组(0.5～2g/d)和高蛋白尿组(>2 g/d)。均符合1999年WHO、IDF公布的糖尿病及DN诊断标准。对照组为同期本院泌尿外科肾癌根治术患者10例，其中男6例，女4例，年龄37～62岁。并取肾脏远离肿瘤组织未被浸润的病理诊断为正常的肾组织。所有对象均排除高血压、急性感染、吸烟等干扰因素，无年龄、性别等统计学差异。

1.2试剂 免疫组化试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；兔抗人TLR4多克隆抗体(美国santa cruz公司)；兔抗人单核细胞趋化蛋白(MCP-1)多克隆抗体(美国santa cruz公司)；兔抗人白细胞介素(IL)-18多克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.3仪器 全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)；石蜡切片机(德国leica公司)；-20℃冰箱(日本HITACHI公司)；恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)。

1.4检测指标及方法 于肾活检前1天收集DN患者血、尿标本，术前收集对照组患者血、尿标本。常规生化方法检测24 h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)。免疫组化法检测各组肾组织标本的TLR4、MCP-1、IL-18的表达，常规石蜡制片、切片、脱蜡。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2 min，3次，过氧化氢孵育10 min，PBS液冲洗，1%Triton-100浸泡10 min，封闭，加入一抗，孵育12 h，PBS液冲洗，加入二抗孵育20 min，二氨基联苯胺(DAB)显色10 min，复染，脱水，封片。

1.5半定量表达评估 对肾小管上皮细胞TLR4、MCP-1、IL-18表达着色面积的评分，计数各抗原呈阳性表达的肾小管上皮细胞占上皮细胞总数的百分率，分值设为0～4分，0分无阳性表达；1分弱表达，阳性细胞率<25%；2分中表达，阳性细胞率占25%～50%；3分为高表达，阳性细胞率占51%～70%；4分为强表达，阳性细胞率占70%以上。每张切片随机选取20个视野(×100倍)，计算20个视野的评分值取平均值，得到各抗原的表达计分。

2 结 果

2.1各组尿蛋白定量、Scr等临床指标的测定 DN组与对照组比较，年龄性别均无显著性差异。DN组患者的24 h尿蛋白定量及Scr水平显著高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 两组临床指标比较±s)

2.2肾组织中TLR4、MCP-1、IL-18的表达 对照组肾组织上皮细胞TLR4无表达，MCP-1、IL-18基本无表达。DN组TLR4、MCP-1、IL-18在肾小管上皮细胞胞浆显棕黄色，明显为高表达，与对照组比较，DN组患者肾小管上皮细胞TLR4、MCP-1、IL-18的表达显著升高(P<0.01)。DN组中高蛋白尿组的各项评分明显高于低蛋白尿组(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组检测肾组织中TLR4、MCP-1、IL-18的表达(×400)

2.3肾组织中TLR4的表达与各炎性因子及临床指标的关系 DN组TLR4的表达水平与MCP-1、IL-18、24 h尿蛋白定量及Scr水平呈显著正相关(R=0.683 39,0.613 31,0.645,0.571 2，P<0.05)。

3 讨 论

DN是糖尿病重要的并发症之一，其最终都会引发肾衰竭。其发病机制可能是病人在高血糖状态下机体氧化应激、肾血流动力学因素的改变等因素相互作用的结果〔3〕。现在的临床治疗对DN只有延缓病情的作用，不能阻止其发展至终末期肾衰竭。糖尿病为一种代谢紊乱引起的慢性炎症疾病，炎性因子是促进糖尿病并发症的主要因素。DN的病理生理过程都有炎症的参与，且对病程的进展起着决定性的因素〔4〕。本研究结果提示蛋白尿在DN引起的肾小管间质炎症中起着重要的作用。TLR4作为一种巨噬细胞受体，是免疫反应上游的重要调节因子，在高糖环境下，激活NF-κB,进而调节MCP-1等炎症因子的转录表达〔5〕。本实验显示，DN组TLR4高表达，TLR4信号通路激活，促进了MCP-1炎性因子的释放，提示DN患者的肾小管上皮细胞中MCP-1的产生于TLR4受体通路有关。在众多炎性因子中，IL-18对DN的发生和发展起着重要的作用〔6〕，本实验还表明DN患者体内的高糖信号通过激活TLR4信号通路，使相关受体活化，诱导IL-18等炎性因子释放，进入促进肾间质炎性的产生及发展。炎症是推进DN发展的重要因素，而尿蛋白量是判定DN炎症损伤的最敏感性指标。TLR4的表达与DN的关系尿蛋白及相关炎性因子与TLR4表达的密切相关性，对探索DN发生、发展的病理机制提供新的靶点。

4 参考文献

1Ohashi K,Burkart V,Flohe S,etal.Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex〔J〕.J Immunol,2000;164(2):558-61.

2Michelsen KS,Doherty TM,Shah PK,etal.TIR signaling: an emerging bridge from innate immunity to atherogenesis〔J〕.J Immunol,2004;173(10):5901-7.

3Schmitz J,Owyang A,Oldham E,etal.IL-33 an interleukin-1 like cytokine that signals via the IL-1 receptor related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines〔J〕.Immunity,2005;23(5): 479-90.

4Tschopp J,Martinon F,Burns K.NALPs: a novel protein family involved in inflammation〔J〕.Nat Rev Mol Cell Bio1,2003;4(2):95-104.

5Amann B,Tinzmann R,Angelkort B.ACE inhibitors improve diabetic Nephropathy through suppression of renal MCP-1〔J〕.Diabetes Care,2003;26(8): 2421-5.

6Navarro-Gonzalez JE，Mora-Fernandez C.The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephro1,2008;19(3):433-42.