余甘子叶药材的HPLC指纹图谱研究

毛健+++刘振杰

[摘要] 目的 建立余甘子叶的指纹图谱。 方法 采用高效液相色谱法测定，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温25℃，紫外检测波长218 nm。 结果 余甘子叶中有15个共有峰被确定为指纹峰，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件评价10批余甘子叶指纹图谱的相似性，其结果均>0.9。 结论 该方法简便，稳定，精密度高，重现性好，可用于余甘子叶的鉴别，作为质量控制方法。

[关键词] 余甘子叶；高效液相色谱法；指纹图谱

[中图分类号] R284.1[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（b）-0011-04

Study on HPLC fingerprint analysis of Phyllanthus emblica L.

MAO Jian1 LIU Zhen-jie2▲

1.Department of Clinical medicine,People′s Hospital of Fuchuan County in Hezhou City of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Fuchuan 542700,China;2.Conservation Center,Guangxi Institute of Medicinal Plant,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530023,China

[Abstract] Objective To establish a method of fingerprint analysis on Phyllanthus emblica L. by HPLC. Methods The chromatographic finger-prints were obtained by HPLC.The detective wave-length was set at 218 nm;the flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was maintained at 25℃. Results 15 co-possessing peaks were selected as the fingerprint peaks of Phyllanthus emblica L. and good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found in fingerprints between the different samples of Phyllanthus emblica L. and the standard fingerprint. Conclusion The method with good reproducibility is simple and accurate,it can be used as an effective quality control method for Phyllanthus emblica L.

[Key words] Phyllanthus emblica L.;High performance of liquid chromatography;Fingerprint

余甘子叶（Phyllanthus emblica L.）系大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）余甘子Phyllanthus emblical L.落叶小乔木或灌木的叶[1]，余甘子树在我国资源丰富，收载于1978年版《藏药标准》、1974年出版的《云南省药品标准》和多版《中华人民共和国药典》，别名有橄榄、滇橄榄、油甘子、山油甘、庵摩勒、牛甘子、喉甘子、杨甘等,余甘子果果实生食酸甜酥脆，初食味酸涩，后回味甘甜爽口，故名余甘[2]。余甘子味甘、酸、涩、性凉，具有化痰止咳，健胃消食，清热生津，保肝解毒等功效[3]。主治感冒发热、咳嗽、咽喉痛、白喉、烦热口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血压、肥胖症、高脂血症、湿热性水肿、尿频、血病、赤巴病、培根病、肝病、心脏病，以治疗血热血瘀引起的血病为长[4]。近年研究表明余甘子具有抗菌[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抗动脉粥样硬化[8-9]、抗乙型肝炎病毒[10]、保肝[11]、增强免疫[12-13]等作用。余甘子有多种化学成分，药理活性研究主要集中在多酚类成分上，槲皮素、没食子酸为其有效成分[14-15]。本实验对余甘子叶进行指纹图谱研究，以期对其质量控制和评价提供有效方法。

1 实验材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪；含在线真空脱气机；高压四元梯度泵；可变波长检测器；二极管阵列检测器Agilent1100；Series色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；SB3200T超声波清洗仪（上海能信超声有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯，乙酸乙酯、磷酸及其他试剂均为分析纯。水为超纯水。槲皮素对照品和没食子酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（槲皮素对照品批号：110081-200406；没食子酸对照品批号：110831-200302）。

1.3 药材

实验所用余甘子叶药材于广西各地及云南玉溪收集，产地和采收时间见表1，经广西中医学院药用植物教研室刘寿养副教授鉴定为余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥叶。

表1 余甘子叶产地和批号

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

取余甘子叶粗粉1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 ml，密塞，称重量。静置1 h，超声30 min后放冷，补重，滤过，精密量取续滤液20 ml，挥干，残渣用25 ml水溶解至分液漏斗中，加入乙酸乙酯振摇提取3次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液为供试品溶液。

2.2 提取溶剂的考察

比较水、无水乙醇、甲醇等提取溶剂，结果表明以甲醇、无水乙醇提取时，所得的色谱图中的色谱峰数较多；余甘子叶的现代研究表明，没食子酸和槲皮素为余甘子叶的有效成分，所以以其没食子酸和槲皮素含量计算，用甲醇为溶剂，药材中没食子酸和槲皮素提取较完全[16]。经综合考虑，选定提取溶剂为甲醇。

2.3 超声时间的考察

样品分别超声20、30、40 min，结果表明，超声的时间为30 min以上，以其没食子酸和槲皮素含量计算，药材提取较完全。故选定提取时间为超声30 min。

2.4 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱（表2）；柱温25℃；检测波长218 nm；进样量5 μl。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，连续进样5次，各色谱峰的相对保留时间RSD<1.42%，相对峰面积RSD<2.94%，结果表明，仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样检测共有峰的相对保留时间RSD<1.30%，相对峰面积RSD<2.47%，结果表明，常温下样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重重复性试验精密称取批号为200701药材5份，制备供试品溶液，连续进样，共有峰的相对保留时间RSD<1.65%，相对峰面积RSD<2.78%，结果表明重现性良好。

2.6 余甘子叶HPLC指纹图谱及技术参数

2.6.1 指纹图谱选择及特征峰的标定测定10批余甘子叶88 min内指纹图谱，获得15个共有峰，由指纹图谱可以看出1号峰峰面积积分百分比较大，分离度及峰形较好，因此选择1号峰作为参照峰，标号为S，其他特征峰依次标号为S，2，3，……，15。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶图谱进行处理得到标准指纹图谱（图1）和指纹图谱纵向叠加图（图2）。

图1 余甘子叶标准HPLC指纹图谱

图2 10批余甘子叶的HPLC指纹图谱纵向叠加图

2.6.2 余甘子叶指纹图谱特征峰相对保留时间和相对峰面积的确定采用10批余甘子叶的指纹图谱，选用1号峰作为参照峰，选取10批样品的共有峰共15个，计算相对保留时间（表3）和相对峰面积（表4）。

2.6.3 指纹图谱相似度的计算采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶指纹图谱进行处理得到指纹图谱相似度分析结果。10批次不同产地余甘子叶样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均>0.9，分别为0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子叶药材与对照指纹图谱有较好的一致性。

3 讨论

余甘子叶药材的成分复杂，本文通过调节流动相洗脱程序，使各成分在整个分析时间段内充分分离洗脱。在流动相系统的选择，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系统，结果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中无法分离，峰形差。在酸性流动相中，磷酸可改善其分离度与峰形，对比甲醇-磷酸系统、乙腈-磷酸，前者洗脱能力较弱，各组分出峰时间太慢，色谱图基线漂移，不能达到中药指纹图谱色谱峰基线分离的要求，故本文选用乙腈-磷酸系统。经过多次优化发现在100 min内能较好地分离余甘子叶中各组分，重现性良好。

本文考察了三种不同的色谱柱对指纹图谱的影响，结果表明，同一色谱方法，不同色谱柱，会产生不同的分离效果，使得某些成分无法达到基线分离，同时，对柱效、峰形也有不同程度的影响。美国热电BDS色谱柱在实验过程中能使各主要有效成分有较好的分离效果，故本文选择了美国热电BDS色谱柱。

余甘子叶中已知成分有没食子酸、槲皮素，两者最大吸收波长为270 nm和370 nm，本文根据此特点，用二极管阵列检测器，分别在210、218、258、270、280、300、360 nm检测色谱图，并同时获得全波长三维色谱图，结果表明218 nm的色谱图能给出最多峰信息，故本文最终选定218 nm为检测波长。

实验结果显示，10批指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分的共有色谱峰峰面积存在一定差异。此研究为快速鉴别和区分不同来源的余甘子叶以及进一步对其进行全面质量控制研究提供了科学的依据，同时对于余甘子叶药材的选购和用药具有一定的指导作用。

[参考文献]

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：167.

[2]王辉.余甘子的化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代中药，2011，13（11）：52.

[3]周涛，邱德文.民族药余甘子的本草药学概况[J].贵阳中医学院学报，2002，24（3）：3.

[4]罗兰.闽药余甘子药理作用及提取分离方法研究进展[J].海峡药学，2013，25（11）：18

[5]钟振国，曾春兰.余甘子叶提取物体外抗菌实验研究[J].中药材，2008，31（3）：428.

[6]曾春兰，钟振国.余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究[J].时珍国医国药，2008，19（3）：580.

[7]潘国庆，赵旭升，蒋炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青海科技，2007，12（6）：33.

[8]王绿娅，王大全，秦彦文，等.余甘子抗脂质过氧化和保护血管内皮的实验研究[J].中国药学杂志，2003，38（10）：505.

[9]刘丽梅，高政，李宝文.余甘子对实验性颈动脉粥样硬化家兔的影响[J].中国临床康复，2003，7（5）：766.

[10]黄正昌，邓学龙，朱宇同，等.台湾细叶油柑体内外抗乙肝病毒作用研究[J].广州中医药大学学报，2000，17（3）：260.

[11]李萍，谢金鲜，林启云.民族药余甘子对D2半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响[J].中国民族民间医药杂志，2003，12（3）：161.

[12]罗春丽.余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳权，何震宇，杨泽民，等.余甘子提取物对小鼠免疫功能的影响[J].时珍国医国药，2010，21（8）：1920.

[14]陈国珍，张颖君，蔡文锋，等.余甘子中水解单宁类化合物体外抗氧化活性研究[J].中国药理通讯，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艳，甄汉深，刘振杰，等.广西余甘子叶醋酸乙酯部位化学成分的研究[J].中成药，2009，31（5）：761

[16]刘晓丽，赵谋明.余甘子果汁活性成分与抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文编辑：郭静娟）

2.5.2 稳定性试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样检测共有峰的相对保留时间RSD<1.30%，相对峰面积RSD<2.47%，结果表明，常温下样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重重复性试验精密称取批号为200701药材5份，制备供试品溶液，连续进样，共有峰的相对保留时间RSD<1.65%，相对峰面积RSD<2.78%，结果表明重现性良好。

2.6 余甘子叶HPLC指纹图谱及技术参数

2.6.1 指纹图谱选择及特征峰的标定测定10批余甘子叶88 min内指纹图谱，获得15个共有峰，由指纹图谱可以看出1号峰峰面积积分百分比较大，分离度及峰形较好，因此选择1号峰作为参照峰，标号为S，其他特征峰依次标号为S，2，3，……，15。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶图谱进行处理得到标准指纹图谱（图1）和指纹图谱纵向叠加图（图2）。

图1 余甘子叶标准HPLC指纹图谱

图2 10批余甘子叶的HPLC指纹图谱纵向叠加图

2.6.2 余甘子叶指纹图谱特征峰相对保留时间和相对峰面积的确定采用10批余甘子叶的指纹图谱，选用1号峰作为参照峰，选取10批样品的共有峰共15个，计算相对保留时间（表3）和相对峰面积（表4）。

2.6.3 指纹图谱相似度的计算采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶指纹图谱进行处理得到指纹图谱相似度分析结果。10批次不同产地余甘子叶样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均>0.9，分别为0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子叶药材与对照指纹图谱有较好的一致性。

3 讨论

余甘子叶药材的成分复杂，本文通过调节流动相洗脱程序，使各成分在整个分析时间段内充分分离洗脱。在流动相系统的选择，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系统，结果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中无法分离，峰形差。在酸性流动相中，磷酸可改善其分离度与峰形，对比甲醇-磷酸系统、乙腈-磷酸，前者洗脱能力较弱，各组分出峰时间太慢，色谱图基线漂移，不能达到中药指纹图谱色谱峰基线分离的要求，故本文选用乙腈-磷酸系统。经过多次优化发现在100 min内能较好地分离余甘子叶中各组分，重现性良好。

本文考察了三种不同的色谱柱对指纹图谱的影响，结果表明，同一色谱方法，不同色谱柱，会产生不同的分离效果，使得某些成分无法达到基线分离，同时，对柱效、峰形也有不同程度的影响。美国热电BDS色谱柱在实验过程中能使各主要有效成分有较好的分离效果，故本文选择了美国热电BDS色谱柱。

余甘子叶中已知成分有没食子酸、槲皮素，两者最大吸收波长为270 nm和370 nm，本文根据此特点，用二极管阵列检测器，分别在210、218、258、270、280、300、360 nm检测色谱图，并同时获得全波长三维色谱图，结果表明218 nm的色谱图能给出最多峰信息，故本文最终选定218 nm为检测波长。

实验结果显示，10批指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分的共有色谱峰峰面积存在一定差异。此研究为快速鉴别和区分不同来源的余甘子叶以及进一步对其进行全面质量控制研究提供了科学的依据，同时对于余甘子叶药材的选购和用药具有一定的指导作用。

[参考文献]

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：167.

[2]王辉.余甘子的化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代中药，2011，13（11）：52.

[3]周涛，邱德文.民族药余甘子的本草药学概况[J].贵阳中医学院学报，2002，24（3）：3.

[4]罗兰.闽药余甘子药理作用及提取分离方法研究进展[J].海峡药学，2013，25（11）：18

[5]钟振国，曾春兰.余甘子叶提取物体外抗菌实验研究[J].中药材，2008，31（3）：428.

[6]曾春兰，钟振国.余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究[J].时珍国医国药，2008，19（3）：580.

[7]潘国庆，赵旭升，蒋炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青海科技，2007，12（6）：33.

[8]王绿娅，王大全，秦彦文，等.余甘子抗脂质过氧化和保护血管内皮的实验研究[J].中国药学杂志，2003，38（10）：505.

[9]刘丽梅，高政，李宝文.余甘子对实验性颈动脉粥样硬化家兔的影响[J].中国临床康复，2003，7（5）：766.

[10]黄正昌，邓学龙，朱宇同，等.台湾细叶油柑体内外抗乙肝病毒作用研究[J].广州中医药大学学报，2000，17（3）：260.

[11]李萍，谢金鲜，林启云.民族药余甘子对D2半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响[J].中国民族民间医药杂志，2003，12（3）：161.

[12]罗春丽.余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳权，何震宇，杨泽民，等.余甘子提取物对小鼠免疫功能的影响[J].时珍国医国药，2010，21（8）：1920.

[14]陈国珍，张颖君，蔡文锋，等.余甘子中水解单宁类化合物体外抗氧化活性研究[J].中国药理通讯，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艳，甄汉深，刘振杰，等.广西余甘子叶醋酸乙酯部位化学成分的研究[J].中成药，2009，31（5）：761

[16]刘晓丽，赵谋明.余甘子果汁活性成分与抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文编辑：郭静娟）

2.5.2 稳定性试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样检测共有峰的相对保留时间RSD<1.30%，相对峰面积RSD<2.47%，结果表明，常温下样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重重复性试验精密称取批号为200701药材5份，制备供试品溶液，连续进样，共有峰的相对保留时间RSD<1.65%，相对峰面积RSD<2.78%，结果表明重现性良好。

2.6 余甘子叶HPLC指纹图谱及技术参数

2.6.1 指纹图谱选择及特征峰的标定测定10批余甘子叶88 min内指纹图谱，获得15个共有峰，由指纹图谱可以看出1号峰峰面积积分百分比较大，分离度及峰形较好，因此选择1号峰作为参照峰，标号为S，其他特征峰依次标号为S，2，3，……，15。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶图谱进行处理得到标准指纹图谱（图1）和指纹图谱纵向叠加图（图2）。

图1 余甘子叶标准HPLC指纹图谱

图2 10批余甘子叶的HPLC指纹图谱纵向叠加图

2.6.2 余甘子叶指纹图谱特征峰相对保留时间和相对峰面积的确定采用10批余甘子叶的指纹图谱，选用1号峰作为参照峰，选取10批样品的共有峰共15个，计算相对保留时间（表3）和相对峰面积（表4）。

2.6.3 指纹图谱相似度的计算采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对10批余甘子叶指纹图谱进行处理得到指纹图谱相似度分析结果。10批次不同产地余甘子叶样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均>0.9，分别为0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子叶药材与对照指纹图谱有较好的一致性。

3 讨论

余甘子叶药材的成分复杂，本文通过调节流动相洗脱程序，使各成分在整个分析时间段内充分分离洗脱。在流动相系统的选择，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系统，结果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中无法分离，峰形差。在酸性流动相中，磷酸可改善其分离度与峰形，对比甲醇-磷酸系统、乙腈-磷酸，前者洗脱能力较弱，各组分出峰时间太慢，色谱图基线漂移，不能达到中药指纹图谱色谱峰基线分离的要求，故本文选用乙腈-磷酸系统。经过多次优化发现在100 min内能较好地分离余甘子叶中各组分，重现性良好。

本文考察了三种不同的色谱柱对指纹图谱的影响，结果表明，同一色谱方法，不同色谱柱，会产生不同的分离效果，使得某些成分无法达到基线分离，同时，对柱效、峰形也有不同程度的影响。美国热电BDS色谱柱在实验过程中能使各主要有效成分有较好的分离效果，故本文选择了美国热电BDS色谱柱。

余甘子叶中已知成分有没食子酸、槲皮素，两者最大吸收波长为270 nm和370 nm，本文根据此特点，用二极管阵列检测器，分别在210、218、258、270、280、300、360 nm检测色谱图，并同时获得全波长三维色谱图，结果表明218 nm的色谱图能给出最多峰信息，故本文最终选定218 nm为检测波长。

实验结果显示，10批指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分的共有色谱峰峰面积存在一定差异。此研究为快速鉴别和区分不同来源的余甘子叶以及进一步对其进行全面质量控制研究提供了科学的依据，同时对于余甘子叶药材的选购和用药具有一定的指导作用。

[参考文献]

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：167.

[2]王辉.余甘子的化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代中药，2011，13（11）：52.

[3]周涛，邱德文.民族药余甘子的本草药学概况[J].贵阳中医学院学报，2002，24（3）：3.

[4]罗兰.闽药余甘子药理作用及提取分离方法研究进展[J].海峡药学，2013，25（11）：18

[5]钟振国，曾春兰.余甘子叶提取物体外抗菌实验研究[J].中药材，2008，31（3）：428.

[6]曾春兰，钟振国.余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究[J].时珍国医国药，2008，19（3）：580.

[7]潘国庆，赵旭升，蒋炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青海科技，2007，12（6）：33.

[8]王绿娅，王大全，秦彦文，等.余甘子抗脂质过氧化和保护血管内皮的实验研究[J].中国药学杂志，2003，38（10）：505.

[9]刘丽梅，高政，李宝文.余甘子对实验性颈动脉粥样硬化家兔的影响[J].中国临床康复，2003，7（5）：766.

[10]黄正昌，邓学龙，朱宇同，等.台湾细叶油柑体内外抗乙肝病毒作用研究[J].广州中医药大学学报，2000，17（3）：260.

[11]李萍，谢金鲜，林启云.民族药余甘子对D2半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响[J].中国民族民间医药杂志，2003，12（3）：161.

[12]罗春丽.余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳权，何震宇，杨泽民，等.余甘子提取物对小鼠免疫功能的影响[J].时珍国医国药，2010，21（8）：1920.

[14]陈国珍，张颖君，蔡文锋，等.余甘子中水解单宁类化合物体外抗氧化活性研究[J].中国药理通讯，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艳，甄汉深，刘振杰，等.广西余甘子叶醋酸乙酯部位化学成分的研究[J].中成药，2009，31（5）：761

[16]刘晓丽，赵谋明.余甘子果汁活性成分与抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文编辑：郭静娟）