杨梅素混合胶束的研制及其体外表征研究

朱婷婷，林彤远，罗 晴，洪小丹，陈卫东

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省高等学校省级现代中药重点实验室，安徽 合肥 230012)

·方药研究·

杨梅素混合胶束的研制及其体外表征研究

朱婷婷1，2，林彤远1，2，罗 晴1，2，洪小丹2，陈卫东1，2

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省高等学校省级现代中药重点实验室，安徽 合肥 230012)

目的研制载有杨梅素(myricetin，Myr)的聚乙二醇-聚乳酸(polyethylene glycol-polylactic acid, mPEG-PLA)/Pluronic F68混合胶束(mixed micelles，MMs)，并对Myr-MMs进行表征及体外释放研究。方法通过丙酮溶剂挥发法研制Myr-MMs，以单因素及L9(34)正交实验优化处方及其工艺；并对制得的载药MMs的粒径、Zeta电位、外观形态、包封率、载药量和体外释放进行研究。结果最优处方制得的Myr-MMs的包封率为(84.65±0.98)%、载药量为(2.73±0.03)%；透射电镜下观察Myr-MMs呈球形或类球形、表面光滑、无粘连；粒径为(41.74±0.27)nm，多分散系数为0.115±0.004；Zeta电位为(-25.47±1.22)mV；体外释放研究发现，MMs体外释药过程近似符合Weibull释药模型：ln(ln(1/(1-Q/100)))=0.927 1lnt-2.057 6(r=0.953 8)。结论利用丙酮溶剂挥发法成功研制了Myr-MMs，其成型好、粒径小、分布均匀，包封率和载药量均较高；且Myr经mPEG-PLA/Pluronic F68 包裹后其体外释放显示出一定的缓释效果。

杨梅素；混合胶束；mPEG-PLA/Pluronic F68；体外释放

杨梅素(myricetin，Myr)又名杨梅树皮素、杨梅黄酮、杨梅酮，属于黄酮类化合物。近年来研究发现，杨梅素具有广泛的药理作用[1]，如抗血小板活化因子、抗氧化、抗肿瘤﹑降血脂﹑保肝护肝等。但由于其水溶性低，口服吸收差，限制了其在临床上的广泛应用。选用合适的载药体系提高Myr的溶解度，同时降低其不良反应成为目前研究的热点[2-4]。拥有溶解性差异很大的疏水端和亲水端的两亲性嵌段共聚物，可在水性环境中组装成介观尺寸范围的聚合物胶束(polymeric micelles，PM)[5]。PM由于其特殊的核-壳结构，具有非常小的粒径范围，疏水链段从亲水外侧被隔开，形成了一个内核，外侧被亲水性链段包围。然而单一聚合物自组装形成的PM由于链段数量的限制，存在载药量低﹑稳定性差﹑生物利用度低等问题[6-7]。近年来出现了大量有关混合胶束(mixed micells,MMs)的研究报道，MMs是由2种或2种以上两亲性聚合物按一定比例混合而得到的胶束体系，与单一胶束比较，包载的药物及其稳定性均得到很大的提高[8-10]。

本实验以聚乙二醇-聚乳酸(polyethylene glycol-polylactic acid, mPEG-PLA)及Pluronic F68为载体材料，采用丙酮溶剂挥发法制备Myr-MMs，同时考察了MMs的理化性质，并以Myr原料药为对照，考察其体外释放特征。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪：LC20-ABSPD-M20A紫外检测器及岛津LC-solution色谱工作站；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；85-2型恒温磁力搅拌器：江苏金坛市环宇科学仪器厂；AB125-S型十万分之一分析天平：德国梅德勒公司；KQ-300B型超声波清洗仪：江苏省昆山超声仪器有限公司；LC-4016低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；Zetasizer 3000HS型激光粒度分度与Zeta电位分析仪：英国Malvern仪器公司；UV-1750紫外分光光度仪：日本岛津公司；0.22 μm微孔滤膜：上海半岛实业有限公司净化器材厂；透析袋：BIOSHARP 公司；JEM-2100型透射电镜：日本JEOL仪器公司。

1.2 试剂与试药 Myr(≥98%，批号 YMS20121214)：西安万昌生物科技有限公司；Pluronic F68(批号 WPYH570B)：北京凤礼精求商贸有限责任公司；mPEG2000-PLA8000(批号 DG-MPEG-PLA145923)：山东省济南岱罡生物工程有限公司；甲醇为色谱纯；其余试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 Myr-MMs的制备 采用丙酮溶剂挥发法制备Myr-MMs，具体步骤如下：称取适量的Myr和mPEG2000-PLA8000，溶于丙酮中形成油相；称取一定量的Pluronic F68，溶于蒸馏水形成水相；将油相在搅拌(1 000 r/min)下匀速逐滴加入水相，挥发过夜，直至挥干丙酮，过0.22 μm微孔滤膜，即得到Myr-MMs溶液。

2.2 药物含量测定

2.2.1 色谱条件：岛津LC-15C高效液相色谱仪：LC-15C高压输液泵、SPD-15C紫外检测器；色谱柱：COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；进样量：20 μL；流动相：甲醇-0.2%磷酸(65∶35)；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；温度：30 ℃。

2.2.2 专属性试验：Myr-MMs和空白MMs供试品溶液的配制：精密量取Myr-MMs溶液0.5 mL至10 mL量瓶中，加入甲醇并定容至刻度，0.22 μm的微孔滤膜滤过后即得Myr-MMs供试品溶液；同法制得空白MMs供试品溶液。对照品溶液的配制：精密称取Myr 5.00 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，得50.00 μg/mL的Myr对照品储备液，置4 ℃冰箱中保存备用。分别取对照品溶液、供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样20 μL，记录色谱图。结果见图1，表明所用辅料对Myr的测定无干扰。

注：A. Myr溶液；B. Myr-MMs；C. 空白MMs。

图1 Myr高效液相色谱图

2.2.3 线性关系考察：分别取适量Myr储备液以色谱甲醇定容，配制0.05、0.10、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μg/mL的Myr溶液，0.22 μm的微孔滤膜过滤，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，记录峰面积。以峰面积积分值(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标进行线性回归，得回归方程y=74 402x-4 411.7(r=0.999 8)，结果表明Myr在0.05～16.00 μg/mL与峰面积呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验：配制Myr低浓度(0.10 μg/mL)、中浓度(2.00 μg/mL)、高浓度(12.80 μg/mL)的标准Myr溶液，分别按“2.2.1”项下方法进样，于1个工作日内连续进样3次，求算日内精密度；于3个工作日内连续进样，每日1次，求算日间精密度。日内RSD分别为2.00%、1.23%、0.44%，日间RSD分别为2.73%、1.44%、0.62%。

2.2.5 重复性试验：取Myr-MMs样品液1 mL稀释至刻度10 mL，平行制得6份，0.22 μm微孔滤膜过滤，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，记录峰面积。结果RSD为1.67%，表明重复性良好。

2.2.6 回收率试验：分别取50.00 μg/mL对照品液320、400、480 μL，加入0.5 mL空白MMs，定容至10 mL，所得浓度即为1.60、2.00、2.40 μg/mL含MMs供试液。每个浓度平行配制3份样品，分别进样，计算峰面积。低浓度(1.60 μg/mL)、中浓度(2.00 μg/mL)、高浓度(2.40 μg/mL)的平均回收率分别为98.6%、100.6%、95.0%。

2.3 包封率和载药量测定 本实验采用超滤离心法作为分离Myr-MMs和游离Myr的方法，并采用高效液相色谱法测定游离Myr和MMs中总Myr含量，通过计算得到Myr-MMs的包封率与载药量。精密量取1.0 mL Myr-MMs溶液置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，轻轻摇匀，取4 mL加至超滤离心管(截留相对分子质量为100 K)内管中，3 500 r/min 离心30 min，超滤液经0.22 μm滤膜过滤后取20 μL进样，计算游离药量(Wfree)。另精密量取0.2 mL Myr-MMs溶液置10 mL量瓶中，加适量甲醇，超声2 min破乳后，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm滤膜过滤后取20 μL续滤液进样测定，记录峰面积，计算总药量(Wtotal)。

包封率=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%。

载药量=(Wtotal-Wfree)/(Wtotal-Wfree+Wmaterial)×100%。

式中Wmaterial指系统的载体材料总质量。

2.4 处方和工艺的优化

2.4.1 单因素实验：以包封率为考察指标，对处方的其他各影响因素进行初步筛选。结果显示投药量、载体材料总量、载体材料比(F68∶mPEG2000-PLA8000)、有机溶剂量等对包封率影响显著，故其具体用量在正交试验中进一步考察。

2.4.2 正交试验：本单因素实验筛选出4个主要影响因素：投药量(A)、载体材料总量(B)、载体材料比(F68∶mPEG2000-PLA8000)(C)、有机溶剂量(D)，因素水平见表1。根据正交试验设计的原理，选择L9(34)正交表设计试验。试验设计及结果见表2，方差分析见表3。以包封率为考察指标时，由表中极差分析可知，各因素影响的主次顺序是A、B、C、D，说明投药量、载体材料总量、载体材料比、有机溶剂量对包封率的影响逐渐减小，最优处方组合是A2B2C3D2。由方差分析可知，投药量对包封率有显著影响。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计与结果(n=3)

表3 方差分析结果

2.4.3 验证实验：按照最优处方制备3批。测定包封率，结果包封率分别为83.99%、84.18%、85.77%。结果显示，包封率较高且重复性较好。

2.5 Myr-MMs理化性质的研究

2.5.1 粒径及Zeta电位测定：粒径是评价纳米粒子一项重要指标，粒径大小及分布直接影响着分散体系的物理稳定性。取Myr-MMs平行3份，室温稀释适当倍数后用激光粒度分布仪测定其粒径及粒度分布，同法测定其Zeta电位。载药胶束的粒径和粒径分布见图2。由图2可以看出，平均粒径为(41.74±0.27)nm，多分散系数(polydispersity index，PDI)为(0.115±0.004)，粒径分布较窄。载药胶束与空白胶束的粒径无明显差别。Zeta电位平均为(-25.47±1.22)mV。

2.5.2 形态学观察：将Myr-MMs滴于电镜制样铜网上，1.5%磷钨酸负染，用滤纸吸取多余染液，铜网于室温下自然干燥后，放入透射电镜中，观察形态并照相，见图3。结果表明，Myr-MMs呈球形或类球形、表面光滑、无黏连，边缘较模糊，内核外有一冠状层，能明显看出胶束的核-壳结构。制得的载药胶束Myr-MMs粒径在47.89 nm左右，与激光粒度分布仪测得的平均粒径基本一致，能很好地反映胶束的形态和粒径分布。

图2 Myr⁃MMs粒径分布图图3 透射电镜下Myr⁃MMs形态(1×500000倍)

2.5.3 初步稳定性考察：将新鲜制备的Myr-MMs溶液密封于西林瓶中，置于4 ℃、25 ℃、60 ℃的恒温箱中，于0、5、15、30 d分别取样测量粒径；同时超滤离心Myr-MMs溶液，测定包封率大小，考察胶束中药物的泄露情况。结果见表4。

表4 初步稳定性考察

结果表明，在60 ℃下，随着放置时间的增加，Myr-MMs的粒径逐渐增加，且增大的趋势很大，PDI增加较明显，说明MMs粒子间发生了聚集；包封率逐步减少，放置30 d后由84.65%减少至55.29%，发生了较为严重的泄露。由此可见，Myr-MMs对热不稳定，应避免在高温下贮存。而在室温下(25 ℃)放置30 d，胶束的粒径只发生较小的变化(由41.74 nm变为57.83 nm)，PDI变化较为微小，由0.115增加至0.139；而包封率由84.65%减少至80.41%，约有5.00%的泄露。低温(4 ℃)放置30 d后，Myr-MMs的粒径、PDI、包封率基本无变化，表明室温或者低温条件下药物可稳定存在于Myr-MMs内核中。

2.6 Myr-MMs的体外释放研究

2.6.1 色谱条件：同“2.2.1”项。

2.6.2 标准曲线的制备：精密量取Myr储备液适量，加pH 2.0缓冲液配制浓度分别为0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL系列标准溶液。同“2.2.3”项操作。Myr在0.05～10.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好，标准曲线为y=22 949x+1 459.6(r=0.999 8)。

2.6.3 专属性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样20 μL，记录色谱图。结果表明此释放介质对Myr的测定无干扰。

2.6.4 精密度实验：取Myr对照品溶液低浓度(0.10 μg/mL)﹑中浓度(1.00 μg/mL)﹑高浓度(8.00 μg/mL)分别在日内和日间连续进样3 d。日内RSD分别为2.05%、1.33%、1.04%，日间RSD分别为1.42%、0.77%、1.71%。

2.6.5 重复性实验：平行制得Myr-MMs样品液6份，进样，计算峰面积。计算得RSD为1.19%，重复性良好。

2.6.6 回收率实验：配制低、中、高浓度的对照品溶液，分别取160、200、240 μL的50 μg/mL对照品液，加入0.5 mL空白MMs，定容至10 mL，所得浓度即为0.80、1.00、1.20 μg/mL。平行配制3份样品，分别进样，计算峰面积。低浓度(0.80 μg/mL)、中浓度(1.00 μg/mL)、高浓度(1.20 μg/mL)的平均回收率分别为96.5%、100.2%、99.5%。

2.6.7 体外释放度的测定：本研究采用透析法对所制备的Myr-MMs的体外释药特征进行考察，以Myr溶液的释放特征为对照，评价Myr经MMs包载后释放行为的变化。分别取1 mL Myr-MMs和等含量的Myr溶液置于预先处理好的透析袋(21 mm，8 000～14 400 Da)中，扎紧两端，放入溶出杯中。释放介质为磷酸盐缓冲液(pH 2.0，加0.5%Tween80)，释放介质容积为40 mL，在37 ℃下100 r/min低速搅拌，平行操作3份。在0、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、36、48 h取样1 mL，同时补加等量等温释放介质，0.22 μm微孔滤膜过滤后，进样20 μL，高效液相色谱法测定，并按下列公式计算累积释药百分比(Q)，绘制释放曲线，见图4。

Q=[ci×V1+(c1+c2+… +ci-1)×V2]/M×100%。

式中c1、c2、ci-1，ci分别为第1、2、i-1、i等时间点释放介质中Myr浓度，V1释放介质总容积；V2所取的样容积，M为投药量。

由结果可知，Myr从溶液中释放迅速，4 h后几乎全部释放，累积释放率达到102.06%。Myr-MMs载体中药物的释放呈现两相特征，即开始阶段的快速释放相和缓释相，在48 h后累积释放率为90.11%。

图4 Myr和Myr-MMs的体外释药特征

对Myr溶液及Myr-MMs的释放动力学按照零级﹑一级、Higuchi方程、Weibull方程和Ritger-Peppas方程进行拟合，所得回归方程见表5。结果表明Myr溶液体外释放特征符合Higuchi模型，而Weibull方程能很好地描述Myr-MMs的释放特征，Myr-MMs的释放动力学方程是ln(ln(1/(1-Q/100)))=0.927 1lnt-2.057 6(r=0.953 8)。

表5 释放特征拟合结果

3 讨论

胶束的形成是通过有机溶剂的扩散自组装形成的，因此有机溶剂在水相中的扩散速度及有机溶剂对药物及载体材料的溶解能力，直接影响到所得胶束的包封率及粒径[11]。本实验中选择了四氢呋喃、无水乙醇、乙腈、丙酮等不同有机溶剂来制备Myr-MMs，并考察其对包封率及粒径的影响。结果显示应用四氢呋喃、无水乙醇、乙腈所制备的MMs的包封率和粒径均不理想，而采用丙酮制备的MMs有着较高的包封率及较小的粒径。

本实验以F68和mPEG2000-PLA8000为载体材料制备MMs。通过查阅文献[7-10]，制备方法较多使用的有薄膜分散法与透析法。由于mPEG2000-PLA8000的水溶性差，药物与载体形成的膜水化后出现针状结晶，药物与载体不能在水化液中自组装成MMs；透析法所得到的胶束粒径较大且不均一，时间长；故综合药物与载体的理化特性及实验条件，选择丙酮溶剂挥发法作为Myr-MMs的制备方法。

由于Myr在水中的溶解度低，在pH 2.0的磷酸盐缓冲液中加入0.5% Tween80[12]。Myr-MMs的体外释放行为主要可分为两相，即突释相与缓释相。药物在前4 h内从Myr-MMs内突释约61.63%，该部分突释的药物可能是吸附在胶束外壳或是粒子表面的游离药物[13]；由于亲水层mPEG的保护使得包裹在MMs内部的药物与水相接触的较少，释放较为缓慢，48 h后约释放90.11%，显示出一定的缓释效果。

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PreparationofMyricetin-loadedMixedMicellesComposedofMethoxyPolyethyleneGlycol-PolylacticAcid/PluronicF68andStudyonItsCharacteristicsandInVitroReleaseProfile

ZHUTing-ting1,2,LINTong-yuan1,2,LUOQing1,2,HONGXiao-dan2,CHENWei-dong1,2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiKeyLaboratoryofModernizedChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo prepare myricetin-loaded mixed micelles composed of methoxy polyethylene glycol-polylactic acid/Pluronic F68 (Myr-MMs) and to study the characteristics andinvitrorelease profile of Myr-MMs.MethodsThe Myr-MMs were prepared by acetone solvent evaporation, and the formula and process were optimized by single-factor test and L9(34) orthogonal experiment. The particle sizes, Zeta potential, appearance, encapsulation efficacy, drug loading, andinvitrorelease of Myr-MMs were studied.ResultsThe encapsulation efficiency and drug loading of Myr-MMs based on the optimized formula were (84.65±0.98)% and (2.73±0.03)%, respectively. The Myr-MMs were spherical or near-spherical, showed smooth surfaces, and had no adhesion, according to transmission electron microscopy. The mean particle size, polydispersity index, and Zeta potential were (41.74±0.27) nm, (0.115±0.004), and (-25.47±1.22)mV, respectively. Theinvitrorelease profile of Myr-MMs followed the Weibull equation: In(In(1/(1-Q/100))) = 0.927 1Int-2.057 6 (r=0.953 8).ConclusionMyr-MMs can be successfully prepared by acetone solvent evaporation, have good appearance, small and uniform particle sizes, and high encapsulation efficiency and drug loading, and show sustainedinvitrorelease.

myricetin; mixed micelles; methoxy polyethylene glycol-polylactic acid/Pluronic F68;invitrorelease

朱婷婷(1989-)，女，硕士研究生

陈卫东，anzhongdong@126.com

R283

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.020

2014-11-18)