RNA干扰HIF-1α对食管鳞癌血管生成拟态的影响

金海林 韩树堂 曾楷峰 肖 斌 张伟锋 施瑞华*

江苏省中医院消化内镜中心1(210029) 江苏省人民医院消化科2

血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是近年肿瘤研究领域提出的新概念。与经典内皮细胞构成的血管不同，VM是由细胞外基质和肿瘤细胞包绕红细胞构成的血管状结构。目前已发现VM存在于恶性黑色素瘤、骨肉瘤、舌鳞状细胞癌、胆囊癌等多种恶性肿瘤中[1-4]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1α是HIF-1的α亚单位，通过感受微环境缺氧对缺氧诱导基因表达进行调节，维持机体对缺氧的适应能力。尧良清等[5]发现西罗莫司可通过抑制HIF-1α mRNA表达而阻断VM的形成。本实验通过检测食管鳞癌VM中HIF-1α的表达以及VM相关基因的表达，旨在探讨HIF-1α在食管鳞癌VM中的作用及其可能的途径。

材料与方法

一、细胞、主要试剂

人胚肾细胞293T、人食管鳞癌细胞株Eca109和TE13、恶性黑色素瘤细胞A375均购自中国科学院上海细胞所。

环形质粒pGC-H1-GFP(上海吉凯基因化学技术有限公司)，感受态大肠杆菌TOP10(南京博尔迪生物科技有限公司)，限制性内切酶BamH Ⅰ、HindⅢ和T4DNA连接酶(Fermantas)，胎牛血清和DMEM(Hyclone)，LipofectamineTM2000(Invitrogen)，克隆环(Sigma)，小鼠抗人HIF-1α、层黏连蛋白(LN)5γ2单克隆抗体(Chemicon)，小鼠抗人VE-cadherin、EphA2单克隆抗体(R&D)，兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)2单克隆抗体(Abcam)，鼠抗人α-tubulin单克隆抗体(Sigma)，HRP标记的羊抗小鼠二抗(Rockland)，BCA蛋白定量、化学发光试剂盒(Pierce)，Matrigel(BD)，Transwell小室(Corning)。

二、方法

1. 细胞培养：所有细胞复苏后培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2条件下培养，或于37 ℃、1% O2(5% CO2、94% N2)的缺氧条件下培养12 h。

2. 质粒构建：按HIF-1α基因序列(NM001530)设计合成3对HIF-1α-siRNA寡核苷酸片段，1号靶正义序列：5’-GAT CCC GAG GAA GAA CTA TGA ACA TAA TTC AAG AGA TTA TGT TCA TAG TTC TTC CTC TTT TTG GAT-3’，反义：5’-AGC TAT CCA AAA AGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA ATC TCT TGA ATT ATG TTC ATA GTT CTT CCT CGG-3’；2号靶正义：5’-GAT CCC GCA CAG GCC ACA TTC ACG TAT ATT CAA GAG ATA TAC GTG AAT GTG GCC TGT GCT TTT TGG AT-3’，反义：5’-AGC TAT CCA AAA AGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT CTC TTG AAT ATA CGT GAA TGT GGC CTG TGC GG-3’；3号靶正义：5’-GAT CCC GAC TGA TGA CCA GCA ACT TGA TTC AAG AGA TCA AGT TGC TGG TCA TCA GTC TTT TTG GAT-3’，反义：5’-AGC TAT CCA AAA AGA CTG ATG ACC AGC AAC TTG ATC TCT TGA ATC AAG TTG CTG GTC ATC AGT CGG-3’。每对寡核苷酸两端分别带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点。将3对正义和反义siRNA寡核苷酸片段各1 μL与48 μL退火缓冲液混合；90 ℃温育4 min，70 ℃温育10 min。缓慢冷却至10 ℃。用HindⅢ和BamHⅠ限制酶将1 μL pGCsi载体线性化。将2 μL退火后的siRNA寡核苷酸片段加入T4DNA连接酶缓冲液，再加1 μL pGCsi载体、5 μL DEPC水、1 μL T4DNA连接酶，室温过夜，构建的质粒分别命名为pGCsi-HIF1、pGCsi-HIF2和pGCsi-HIF3。将重组质粒和空载体转化入感受态大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB平板上培养过夜后挑选单克隆，接种至LB液体培养基，振摇培养过夜，次日行质粒纯化抽提，测定浓度后-20 ℃保存。部分质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

3. 瞬时转染：将293T细胞分为未转染组、pGCsi-HIF1组、pGCsi-HIF2组、pGCsi-HIF3组和空载体组。转染前1 d取对数生长期293T细胞2.5×105个接种于35 mm培养皿，培养于不含抗菌药物的DMEM培养液(含10%胎牛血清)，次日观察细胞生长至约90%聚合时开始转染。取质粒4 μg和10 μL LipofectamineTM2000稀释于不含抗菌药物的DMEM，室温孵育20 min后加入培养皿，37 ℃、5%CO2培养，6 h后更换含10%胎牛血清的DMEM培养液。分别于48、72 h收集细胞，筛选用于后续实验的质粒。

4. 稳定转染：Eca109和TE13细胞瞬时转染步骤与293T细胞相同。转染后24 h按1∶12的比例传代，48 h后分别用含800、400 mg/L的G418选择性培养液进行筛选，约4周后挑取克隆在G418选择性培养液中继续传代，扩大培养。以转染空载体质粒的细胞作为阴性对照，以培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液的细胞作为空白对照。各组细胞分别命名为Eca109/siHIF、Eca109/Neo、Eca109、TE13/siHIF、TE13/Neo和TE13。

5. 三维培养：24孔培养板每孔加入300 μL Matrigel原液(冰浴上进行)，37 ℃培养30 min，每孔添加1 mL 5×105/mL各组细胞悬液(以黑色素瘤A375细胞为阳性对照)，继续培养12 h，观察食管癌细胞的管状结构排列情况和完整程度。随机于倒置显微镜下(×200)取上、下、左、右、中心5个视野，计数管状结构数量，取均值，实验重复三次。

6. 蛋白质印迹法：提取各组细胞蛋白，BCA法定量，取总蛋白40 μg加热变性后上样，行40 mA稳流SDS-PAGE电泳，100 V稳压冰浴电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后TBST漂洗5 min×3次，加入一抗(HIF-1α 1∶500，VE-cadherin 1∶500，EphA2 1∶500，LN5γ2 1∶200，MMP2 1∶2 000)4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗后，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗，ECL法显影。

三、统计学分析

结 果

一、pGCsi-HIF重组质粒的鉴定

测序结果证实插入的shRNA序列与设计序列100%相符(见图1)。

二、蛋白质印迹法鉴定质粒的干扰效果

与未转染细胞相比，分别转染pGCsi-HIF2和pGCsi-HIF3质粒的293T细胞中HIF-1α蛋白表达均下降，其中转染pGCsi-HIF3质粒72 h后的293T细胞蛋白表达最低，而仅转染空质粒的细胞中HIF-1α蛋白表达无明显差异(见图2)。因此，后续实验使用pGCsi-HIF3质粒转染食管鳞癌细胞。

三、RNA干扰对食管鳞癌细胞HIF-1α的沉默效果

稳定转染pGCsi-HIF3质粒后，Eca109/siHIF和TE13/siHIF细胞在荧光显微镜下均可见绿色荧光(见图3)，表明细胞能稳定表达质粒中绿色荧光蛋白。蛋白质印迹法结果表明Eca109/siHIF和TE13/siHIF细胞中HIF-1α蛋白表达均受到显著抑制，与两组对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(见图4)。

四、沉默HIF-1α抑制食管鳞癌VM形成

与A375细胞相似，Eca109和TE13细胞在Matrigel上均能模拟血管内皮细胞的特性并相互连接，约12 h后形成血管网状样结构，呈单个环状或多个环相连的网格状，转染空载体质粒的细胞亦有相似表现。稳定转染组细胞体外管道形成能力受到显著抑制，环状结构断裂，管状结构数目明显少于两组对照组(P<0.05)(见图5)。

A：pGCsi-HIF1；B：pGCsi-HIF2；C：pGCsi-HIF3

1 Da=0.9921 u

A：Eca109/siHIF；B：TE13/siHIF

1：Eca109；2：Eca109/Neo；3：Eca109/siHIF；4：TE13；5：TE13/Neo；6：TE13/siHIF

五、VM相关基因的表达

常氧下Eca109/siHIF和TE13/siHIF细胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表达均被显著抑制，与两组对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而MMP2表达无明显变化。缺氧条件下，未转染组和空质粒组细胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表达较常氧下明显增强(P<0.05)，而MMP2表达无明显差异(P>0.05)；缺氧培养后稳定转染细胞中HIF-1α、VE-cadherin、EphA2、LN5γ2、

MMP2表达与常氧培养相比并无明显增加(P>0.05)(见图6)。

*与相应未转染细胞比较，P<0.05

讨 论

1999年Maniotis等[1]对侵袭性黑色素瘤的研究发现了一种由肿瘤细胞包绕而无内皮细胞被覆、由PAS染色阳性的细胞外基质间隔的管腔，并将这种微循环结构称为VM，VM为肿瘤提供了一种新的血液供应方式和途径。进一步研究发现VM倾向存在于高度恶性的肿瘤组织中[6]，且VM往往预示多种肿瘤患者的预后不良[4,7-11]。VM的分子机制目前已形成了相关假说，然而，确切的机制及其所依赖的关键信号通路尚未达成一致。

图6 蛋白质印迹法检测两株食管鳞癌细胞中HIF-1α、EphA2、VE-cadherin、MMP2和LN5γ2的表达

Sun等[12]利用恶性黑色素瘤细胞B16接种后肢股动脉结扎的7周龄C57小鼠和未结扎小鼠， 结果发现结扎小鼠肿瘤组织VM数量明显多于对照组，且与HIF-1α表达呈正相关，与MMP2、MMP9和VEGF表达不相关，提示肿瘤组织VM的形成与局部缺血缺氧微环境相关。本研究中，构建特异性针对HIF-1α的shRNA质粒后瞬时转染293T细胞，蛋白质印迹法显示pGCsi-HIF3质粒的干扰效果最强。随后将该质粒稳定转染两株高度恶性食管鳞癌细胞株Eca109和TE13，蛋白质印迹法结果示获得的单克隆干扰效果满意。由于VM最早在恶性黑色素瘤中发现，故常将其作为阳性对照。本研究基于Matrigel的体外三维培养实验亦以恶性黑色素瘤细胞A375为阳性对照，结果表明与A375细胞相似，两株食管鳞癌细胞均可形成血管网状样结构，而稳定干扰组细胞形成管状结构的能力被显著抑制。提示高度恶性食管鳞癌中存在VM，且HIF-1α对VM的发生有重要作用，与Sun等[12]的研究结果一致。

研究发现VM的形成与VE-cadherin、EphA2、LN5γ2和MMP2等表达密切相关[13-14]。本研究发现，HIF-1α表达沉默后，两株食管鳞癌细胞中VE-cadherin、EphA2表达受到明显抑制，而MMP2表达无明显变化；Eca109/siHIF细胞中LN5γ2表达完全沉默，而TE13/siHIF细胞中尚可见少量表达，但显著低于对照组，这个差异可能与不同细胞株之间的差异有关。缺氧条件下两株食管鳞癌细胞中VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表达较常氧条件下明显增加，而MMP2表达无明显差异。提示VE-cadherin、EphA2、LN5γ2中可能存在HIF-1α的靶基因，而MMP2与HIF-1α无明显关系。

最新研究发现仅以靶向经典血管的药物治疗并不能完全阻断肿瘤细胞的血供[15]，而联合靶向VM的药物能取得更好的疗效。因此VM的研究对肿瘤治疗极具临床价值。

综上所述，本研究发现HIF-1α在食管鳞癌VM形成的信号转导通路中有重要作用，其机制可能是通过直接或间接调节VE-cadherin、EphA2、LN5γ2表达而发挥作用，使肿瘤在缺氧微环境中获取营养。然而，HIF-1α在食管鳞癌中调控VM发生、发展的确切机制和信号通路有待进一步深入研究。

1 Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, et al. Vascular channel formation by human melanoma cellsinvivoandinvitro: vasculogenic mimicry[J]. Am J Pathol, 1999, 155 (3): 739-752.

2 Cai XS, Jia YW, Mei J, et al. Tumor blood vessels formation in osteosarcoma: vasculogenesis mimicry[J]. Chin Med J (Engl), 2004, 117 (1): 94-98.

3 张小根, 刘春栋, 罗陆侨, 等. 舌鳞状细胞癌中血管生成拟态的临床意义[J]. 南方医科大学学报, 2013, 33 (4): 593-597.

4 范跃祖, 孙伟, 张文忠, 等. 原发性胆囊癌患者肿瘤血管生成拟态及其临床意义[J]. 中华医学杂志, 2007, 87 (3): 145-149.

5 尧良清, 丰有吉, 丁景新, 等. 缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的前期研究[J]. 中华妇产科杂志, 2005, 40 (10): 662-665.

6 张诗武, 孙保存. 肿瘤血管生成拟态研究进展[J]. 中华病理学杂志, 2007, 36 (10): 694-697.

7 Li M, Gu Y, Zhang Z, et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of gastric adenocarcinoma[J]. Pathol Oncol Res, 2010, 16 (2): 259-266.

8 Vartanian AA, Stepanova EV, Gutorov SL, et al. Prognostic significance of periodic acid-Schiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma[J]. Can J Urol, 2009, 16 (4): 4726-4732.

9 Baeten CI, Hillen F, Pauwels P, et al. Prognostic role of vasculogenic mimicry in colorectal cancer[J]. Dis Colon Rectum, 2009, 52 (12): 2028-2035.

10 Liu R, Yang K, Meng C, et al. Vasculogenic mimicry is a marker of poor prognosis in prostate cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2012, 13 (7): 527-533.

11 牛膺筠, 刘夫玲, 杨莹, 等. 视网膜母细胞瘤血管生成拟态与临床病理学特征关系的研究[J]. 中华眼科杂志, 2009, 45 (4): 318-322.

12 Sun B, Zhang D, Zhang S, et al. Hypoxia influences vasculogenic mimicry channel formation and tumor invasion-related protein expression in melanoma[J]. Cancer Lett, 2007, 249 (2): 188-197.

13 Hess AR, Seftor EA, Gardner LM, et al. Molecular regulation of tumor cell vasculogenic mimicry by tyrosine phosphorylation: role of epithelial cell kinase (Eck/EphA2) [J]. Cancer Res, 2001, 61 (8): 3250-3255.

14 Paulis YW, Soetekouw PM, Verheul HM, et al. Signalling pathways in vasculogenic mimicry[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1806 (1): 18-28.

15 Itzhaki O, Greenberg E, Shalmon B, et al. Nicotinamide inhibits vasculogenic mimicry, an alternative vascularization pathway observed in highly aggressive melanoma[J]. PLoS One, 2013, 8 (2): e57160.