尾巨桉愈伤组织蛋白质含量和氧化酶活性比较

刘敏燕+沙月娥+欧阳乐军+张润桃+梁卓玲+甘四明

摘要:以尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E. grandis)无性系DH32-29无菌苗的茎段为外植体,优化的激素组合的愈伤组织诱导率高,随后培养中愈伤组织分化出绿色､黄绿色､白色和褐色4种类型,绿色和部分黄绿色的为胚性愈伤组织,后两种为非胚性愈伤组织｡分别测定不同类型愈伤组织的蛋白质含量以及超氧化物歧化酶(SOD)､过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,结果表明,愈伤组织蛋白质含量从高到低为绿色､黄绿色､白色､褐色;胚性愈伤组织的SOD､POD和CAT活性显著高于非胚性愈伤组织,并且绿色愈伤组织3种酶活性均高于其他愈伤组织｡

关键词:尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E. grandis);愈伤组织;过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT);超氧化物歧化酶(SOD)

中图分类号:S792.39;Q946.5文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2581-03

Comparisons of Protein Contents and Oxidase Activity in Callus of

Eucalyptus urophylla×E. grandis Clone

LIU Min-Yan1,SHA Yue-E1,OUYANG Le-Jun1,ZHANG Run-Tao1,LIANG Zhuo-Lin1,GAN Si-Ming2,3

(1.College of Life Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong, China; 2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091,China; 3. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520)

Abstract: The MS medium was optimized with several hormone combinations for inducing hypocotyls of Eucalyptus urophylla × E. grandis clone DH32-29 to form callus. And the callus rate was high. The callus was differentiated into four types in subsequent culture including green, yellowish, white and brown calluses, in which the green and partial yellowish calluses were embryonic whereas the latter two were non-embryonic. Each callus type was sampled for measuring of protein content and enzymatic activity of superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD) and catalase(CAT). Results showed that the green callus had the highest protein content, followed by the yellowish, white and brown ones. In general, the embryonic callus had a higher SOD, POD and CAT activity than the non-embryonic had. The green callus had the highest activity of the three enzymes.

Key words: Eucalyptus urophylla × E. grandis; callus; superoxide dismutase(SOD); peroxidase(POD); catalase(CAT)

基金项目:国家“863”计划项目(2013AA102705);广东省大学生创新训练项目(1057912038);广东省自然科学基金项目(S2013040014690);湛江市科技攻关项目(2011C3104010);湛江师范学院人才引进专项(ZL1302)

桉树是桃金娘科(Myrtaceae)杯果木属(Angophora)､伞房属(Corymbia)和桉属(Eucalyptus)植物的统称,它具有速生､丰产和优质等优点,已成为全球性的重要造林树种,是优良的纸浆､人造板和家具等工业用材,经济效益显著[1]｡尾叶桉(E. urophylla)与巨桉(E. grandis)的杂交种具有明显的杂种优势,其良种在适应性和经济性状上均表现优良｡尾巨桉无性系已在广东､广西､海南和福建等地大面积推广,造林面积已占全国桉树人工林的40%以上,成为栽培面积最大的一类桉树无性系[2]｡目前,其种苗繁育一直是通过组织培养,而体细胞胚胎发生途径尚未开展研究｡并且,尾巨桉胚性细胞繁殖快､同步性好,具有很强的接受外源DNA的能力,是进行外源基因转化的理想材料,有利于建立高效的遗传转化体系;此外,胚性细胞诱导也广泛用于离体种子资源的保存[3]｡

胚性愈伤组织的高频发生体系是胚性细胞诱导的前提,需要区分其与木质化程度高､活力不强､难以接受外源基因的非胚性愈伤组织的生理生化差别｡近年来,在植物胚性细胞发育及胚状体发生过程的研究上,研究者已越来越多地探讨体细胞胚性的启动及胚状体发生的生理和分子机制｡胚状体发生是体细胞脱分化､进而再分化的过程,与大量酶的特异合成和代谢相关｡已有研究发现,过氧化物酶(POD)和酯酶(EST)等在胚状体发生中呈现一定的规律性[4],超氧化物歧化酶(SOD)､POD､过氧化氢酶(CAT)与胚性细胞的发育密切相关[5]｡

试验以尾巨桉无性系DH32-29无菌苗的茎段为外植体,MS为基本培养基,添加蔗糖､琼脂､2,4-D和PBU诱导愈伤组织;随后培养的愈伤组织分化出绿色､黄绿色､白色和褐色4种类型｡绘制蛋白质标准曲线,利用紫外分光光度计测定不同类型愈伤组织中蛋白质的含量以及SOD､POD和CAT的酶活性,分析愈伤组织生理生化指标与胚性愈伤组织诱导的相关性｡这将为提高DH32-29的胚性愈伤组织诱导率和不定芽分化率奠定技术基础,也可为其他桉树无性系的胚性愈伤组织诱导提供借鉴和参考｡

1材料与方法

1.1材料

试验所用材料为尾巨桉无性系DH32-29无菌苗的茎段｡

试剂包括考马斯亮蓝G-250染料､95%乙醇､0.1 g/L结晶牛血清蛋白､愈创木酚､0.1 mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液､30% H2O2､0.1 mol/L H2O2､0.05 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液(含 0.1 mmol/L EDTA)､0.13 mol/L甲硫氨酸等,试剂均为国产分析纯,购自广州化学试剂厂｡

1.2方法

1.2.1胚性愈伤组织诱导将外植体接种于愈伤组织诱导培养基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.1 g/L VC,添加不同浓度的KT与2,4-D组合､PBU与IAA组合以及6-BA与2,4-D组合,pH 5.8~6.0),(25±2) ℃下暗培养14 d,接着光暗交替培养7 d,计算愈伤组织诱导率和观察胚性愈伤组织形成情况｡

1.2.2蛋白质含量及SOD､POD､CAT活性测定

1)酶液的制备｡分别取绿色､黄绿色､白色和褐色愈伤组织0.4 g于预冷的研钵中,加入8 mL预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液,磨成匀浆｡将匀浆转入10 mL离心管,1 000 r/min离心15 min,取上清液定容至10 mL,4 ℃保存｡

2)蛋白质含量测定标准曲线的绘制｡分别吸取1 g/L标准蛋白质溶液0､0.01､0.02､0.03､0.04､0.05和0.06mL于10 mL具塞试管中,再分别加入0.15 mol/L NaCl 0.10､0.09､0.08､0.07､0.06､0.05和0.04 mL,各管再加入考马斯亮蓝G-250溶液5 mL,混匀,室温放置10 min,于595 nm处测吸光度｡以A595 nm为依变量(y)､蛋白质浓度为自变量(x)进行线性回归,并绘制标准曲线｡

3)蛋白质含量测定｡分别准确吸取4种愈伤组织酶液0.1 mL于试管中,各管加入考马斯亮蓝5 mL,测其A595 nm,计算蛋白质含量｡

4)SOD活性测定｡取10 mL试管5支,1支为暗对照,1支为光照对照,剩下3支为样品重复测定｡分别在560 nm下测定各管的吸光度,计算SOD活性｡具体操作及计算方法参考文献[6]｡

5)POD活性测定｡取10 mL试管5支,1支为暗对照,1支为光照对照,剩下3支为样品重复测定｡分别在470 nm下测定各管的吸光度,每隔1 min记录1次A470 nm,共记录5次,然后以每分钟内A470 nm变化0.01为1个酶活性单位(U)｡具体操作及计算方法参考文献[6]｡

6)CAT活性测定｡取10 mL试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,加样后在240 nm下比色,每隔1 min读数1次,共测4 min,计算CAT活性｡具体操作及计算方法参考文献[6]｡

2结果与分析

2.1蛋白质标准曲线的绘制

蛋白质标准曲线如图1所示,得回归方程:y=0.008 8x+0.012 9(r2=0.995 6)｡由图1可知,蛋白质在0~60 μg/mL浓度范围内与A595 nm线性关系良好｡

2.2不同植物生长调节剂组合对胚性愈伤组织诱导的影响

接种6~8 d后,DH32-29外植体两端产生愈伤组织,整个外植体呈哑铃状,以后逐渐从两端开始延伸形成膨大的愈伤组织｡诱导形成的愈伤组织色泽､结构各异,主要有绿色､黄绿色､白色和褐色4种类型(图2)｡其中,绿色愈伤组织活力最好,最先直接分化出绿色芽点,形成不定芽;部分较淡的黄绿色愈伤组织在光照条件下也能慢慢转绿､分化活力增强,但也有部分在后续培养中变白､玻璃化;白色愈伤组织大多数不能进一步分化形成不定芽;褐色愈伤组织活力最差,不能进一步分化,渐渐干枯死亡｡前两种愈伤组织在后续继代过程中,表面逐渐诱导出呈颗粒状的胚性细胞团,形成胚性愈伤组织,大约占整个愈伤组织的80%左右;后两种愈伤组织为非胚性愈伤组织｡

2.3胚性与非胚性愈伤组织几项生理指标的差异

DH32-29胚性与非胚性愈伤组织的几项生理指标差异见表1｡由表1可知,绿色愈伤组织中蛋白质含量最高,其次为黄绿色愈伤组织,褐色愈伤组织的最低,即胚性愈伤组织相对非胚性愈伤组织蛋白质含量要高,推测是因为胚性愈伤组织中的胚性细胞为胚状体发生储存营养｡绿色愈伤组织的SOD､POD和CAT活性比其他颜色愈伤组织高,胚性与非胚性愈伤组织中SOD､POD和CAT活性存在显著差异｡

3小结与讨论

胚性愈伤组织具有再生潜能,是良好的转基因受体材料;非胚性愈伤组织难以转化成功,也难以再生成植株｡愈伤组织质量决定遗传转化的成败,也是影响高效再生的决定因素｡本研究通过不同植物生长调节剂的优化组合诱导得到胚性愈伤组织,并实现胚性愈伤组织的再生｡植物胚性愈伤组织形成过程中,相关酶类的活性变化十分明显｡比如POD是木质素合成最后过程中的一种关键酶,随着植株体内的过氧化物酶含量下降,木质素含量也随之大幅度下降[7];尾叶桉中,黄真池等[8]发现具有高分化能力的浅绿色愈伤组织的POD､SOD和CAT等活性都要高于褐色和白色愈伤组织｡SOD与机体衰老､营养状况和辐射防护有关,而CAT也是一种生物体内的保护酶｡Rajeswari等[9]报道, 香合欢(Albizia odoratissima)具分化能力愈伤组织的CAT活性明显高于不具分化能力的愈伤组｡

张献龙等[10]指出,胚性愈伤组织中蛋白质含量较高,推测在胚性愈伤组织形成过程中糖和淀粉转化成蛋白质｡本研究以不同类型的愈伤组织为材料,发现胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织中POD活性的差异较明显,表明胚性愈伤组织的生理代谢能力较强､清除氧自由基的能力高､不易老化､活力旺盛;虽然胚性愈伤组织中蛋白质含量､SOD和CAT活性均比非胚性愈伤组织中的高,但差异没有POD的大｡刘成圣等[11]在对苜蓿(Medicago sativa)体细胞发生和发育过程的研究也发现,胚性愈伤组织SOD活性和POD活性比非胚性愈伤组织活性高,与本研究结果相似｡Laukkanen等[12]的研究也发现欧洲赤松(Pinus sylvestris)褐色组织中SOD活性比非褐色组织中的低｡

深入研究尾巨桉无性系胚性愈伤组织的诱导条件以及胚性愈伤组织中POD､SOD和CAT等酶活性的变化规律,有助于寻找合适的培养基配方和培养条件､提高具分化能力的胚性愈伤组织的比例和提高不定芽的分化能力,也将为其他桉树无性系的胚性愈伤组织诱导提供借鉴和参考｡

参考文献:

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