硒化枸杞多糖的制备及其抗氧化性研究

郝苗，金黎明，刘李娜，许永斌，马堃，范圣第

（1．大连市产品质量监督检验所，辽宁大连 116021；2．大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600；3．海军医学研究所，上海 200443）

硒化枸杞多糖的制备及其抗氧化性研究

郝苗1，金黎明2，*，刘李娜3，许永斌2，马堃2，范圣第2

（1．大连市产品质量监督检验所，辽宁大连 116021；2．大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600；3．海军医学研究所，上海 200443）

摘 要：以亚硒酸钠和枸杞多糖为原料合成硒化枸杞多糖，电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定其中硒含量为64.42 mg/g。利用紫外-可见光谱、红外光谱两种表征手段，证实了硒化枸杞多糖的合成。采用邻二氮菲-Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法测定硒化枸杞多糖的抗氧化能力，结果表明，在实验设置的浓度范围内，硒化枸杞多糖的抗氧化能力随着浓度的增加而增加，且高于枸杞多糖。2.0 mg/mL的枸杞多糖和硒化枸杞多糖对超氧阴离子自由基的清除率分别为51.48%和59.34%，对羟自由基的清除率分别为50.23%和56.16%。本实验为进一步研究硒化枸杞多糖作为抗氧化能力较强的食品和药品的可能性奠定了基础。

关键词：硒化枸杞多糖；合成；表征；电感耦合等离子体质谱；抗氧化性

枸杞是我国传统名贵中药材，素有“红宝”美称， 富含植物多糖、蛋白质、维生素等营养成分。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP） 是枸杞主要的有效成分之一，具有增强机体免疫调节功能、减少体内脂肪含量、抗肿瘤、抗衰老等多种生理功能[1]。

硒（selenium）是人体所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗癌、延缓衰老、增强人体免疫力等功效。但大多数无机硒化合物毒性较大，应用受到了限制。硒多糖作为一种有机硒化合物，使用安全且兼有硒与多糖二者的活性，更加易于机体吸收和利用[2]。目前已有许多研究证明，硒多糖具有抗氧化、抗金属中毒、抗癌细胞和病毒等多种作用[3-4]。

某些动植物和微生物体内含有天然硒多糖，但含量很少，使硒多糖的研究受到了一定限制。近年来，研究者尝试使用人工方法获得硒多糖，如在合适的培养条件下把无机硒添加到藻类、真菌等培养基中，通过生物体自身富集和转化来获得硒多糖[5-6]。或者利用化学合成方法获得硒多糖，如硒化角叉菜胶[7]、硒化红薯叶多糖[8]、硒化白沙蒿多糖[9]、硒化羧甲基壳聚糖[10]等。

本实验以亚硒酸钠和枸杞多糖为原料合成硒化枸杞多糖（selenium-Lycium barbarum polysaccharide，SeLBP），利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定其中硒含量，利用紫外-可见光谱、红外光谱两种方法对其进行表征，并采用邻二氮菲-Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法测定SeLBP的抗氧化能力。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

枸杞提取物，西安天一生物技术有限公司。抗坏血酸（VC），亚硒酸钠，无水乙醇，冰乙酸，盐酸，硝酸，甲苯，浓硝酸，双氧水，邻苯三酚，邻二氮菲等，均为国产分析纯试剂。

1.1.2 仪器

Lambda25型紫外-可见分光光度计：美国PE公司；370DTGS型红外光谱仪：美国Thermo公司；7700X Series型电感耦合等离子体质谱仪：美国Agilent公司；DF-101S型恒温磁力搅拌器：巩义市英峪于华仪器厂；DHG-9070A型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SevenEasy型pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枸杞多糖的纯化

称取适量枸杞多糖提取物，用2倍体积的乙酸乙酯脱脂，充分摇匀静置后，取滤渣。加入适量蒸馏水将干燥后的滤渣溶解，加入25%体积的正丁醇-氯仿混合液（正丁醇∶氯仿=1∶4），剧烈振荡20min。4000r/min离心10 min，倾出上清液，除去中间层变性蛋白和下层氯仿。重复以上操作，直至中间层无变性蛋白。

向上清液中加入3倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏过夜，得到多糖沉淀，冷冻干燥得到纯化的LBP。

1.2.2 枸杞多糖中多糖含量测定

用苯酚-硫酸法测定LBP中多糖含量[11]。

1.2.3 硒化枸杞多糖的制备

参考梁淑轩等[12]的方法，称取1 g纯化后的LBP溶解于25 mL超纯水中，磁力搅拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亚硒酸钠溶于少量超纯水，缓慢加入LBP溶液中，磁力搅拌器上50℃下反应48 h。加入3倍体积无水乙醇，使其沉淀完全。离心得到沉淀后用无水乙醇洗涤3次，加入少量的超纯水溶解，用超纯水透析24 h，未透液经冷冻干燥得到SeLBP。

1.2.4 紫外光谱法测定

将LBP和SeLBP用去离子水配成0.5 mg/mL的溶液，用去离子水为参比，进行紫外光谱测定，波长扫描范围为190 nm～400 nm。

1.2.5 红外光谱法测定

将少量的LBP和SeLBP用KBr压片，进行红外吸收光谱测定，测定范围为400 cm-1～4 000 cm-1。

1.2.6 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定硒含量

准确称取适量SeLBP于干燥的聚四氟乙烯消解罐内，加入4 mL硝酸，1 mL H2O2摇匀，密封，置入微波消解系统中进行消解，消解完全后，用少量超纯水洗罐3次～4次，定容。上ICP-MS测定，样品定量分析采用外标法，内标元素选用89Y。做3个平行实验，得出平均值。根据标准曲线计算出其中硒含量。

1.2.7 抗氧化能力测定

采用邻苯三酚自氧化法测定LBP和SeLBP清除超氧阴离子自由基的能力，并以VC为对照实验[13]。

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定LBP和SeLBP清除羟自由基的能力，并以VC为对照实验[13]。

2 结果与讨论

2.1 枸杞多糖中多糖含量测定

根据图1葡萄糖标准曲线，计算得出纯化后的LBP中多糖百分含量为66.44%。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 硒化枸杞多糖的制备及硒含量测定

得到的SeLBP为深黄色固体，产率为56.81%。经ICP-MS测定其中硒含量为64.42 mg/g。

目前化学法合成硒化多糖常用SeOCl2、亚硒酸、亚硒酸钠等作为硒化试剂。Junlong Wang等[9]用H2SeO3/HNO3和BaCl2做催化剂，合成了硒化白沙蒿多糖，发现强酸会使多糖降解。本实验参考了梁淑轩等[12]的方法，以醋酸做为催化剂，反应条件为50℃，反应48 h。制备得到的SeLBP中硒含量为64.42mg/g，显著高于一些文献报道，如合成的硒化红薯叶多糖中硒含量为 358 μg/g[8]、硒化白沙蒿多糖中硒含量为 1 703 μg/g[9]、硒化羧甲基壳聚糖中硒含量为20.50 mg/g[10]。

2.3 紫外图谱

LBP紫外光谱见图2。

图2 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的紫外吸收光谱图Fig.2 UV spectrum of LBP and SeLBP

从图2中可以看出，LBP经硒化后，最大吸收峰从281 nm转移到275 nm，峰值的变化表明了LBP中成功引入了亚硒酸根。

2.4 红外图谱

LBP和SeLBP的红外光谱见图3。

图3 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的红外光谱图Fig.3 IR spectrum of LBP and SeLBP

由图3可知，LBP经硒化后的红外图谱变化不大，说明多糖的结构基本没有改变。硒化后，在795 cm-1处出现有亚硒酸酯的特征吸收峰。LBP的C6-OH的伸缩振动峰由1 026 cm-1红移至1 031 cm-1，说明C6上的-OH可能参与了硒化反应。

2.5 对超氧阴离子自由基的清除作用

LBP和SeLBP对超氧阴离子自由基的清除作用结果见图4。

图4 枸杞多糖和硒化枸杞多糖对超氧阴离子自由基的清除率曲线Fig.4 Curves of scavenging effect on superoxide radicals of LBP and SeLBP

从图4可以看出，LBP和SeLBP对超氧阴离子自由基均有不同程度的清除作用，随着浓度的增加而增强，且SeLBP的清除作用强于LBP。浓度为2.0 mg/mL的LBP和SeLBP对超氧阴离子的清除率分别为51.48%和59.34%，高于2.0 mg/mL的VC。

2.6 对羟自由基的清除作用

LBP和SeLBP对羟自由基的清除作用结果见图5。

图5 枸杞多糖和硒化枸杞多糖对羟自由基的清除率曲线Fig.5 Curves of scavenging effect on hydroxyl radicals of LBP and SeLBP

从图5可以看出，LBP和SeLBP对·OH都具有一定的清除作用，呈浓度依赖关系，且SeLBP的清除能力更强。以浓度为2.0 mg/mL的LBP和SeLBP为例，对·OH的清除率分别为50.23%和56.16%，接近于2.0 mg/mL 的 VC。

3 结论

本实验以亚硒酸钠和LBP为原料合成SeLBP，ICP-MS测定其中硒含量为64.42 mg/g。利用紫外-可见光谱、红外光谱两种表征手段，证实了SeLBP的合成，硒化反应主要通过C6上的-OH完成。SeLBP的抗氧化能力呈浓度依赖关系，且由于引入了硒这种具有抗氧化能力的元素，在同样浓度条件下的抗氧化能力要高于LBP。2.0 mg/mL的LBP和SeLBP对超氧阴离子自由基的清除率分别为51.48%和59.34%，对羟自由基的清除率分别为50.23%和56.16%。本实验合成的SeLBP既具有抗氧化能力，又有补硒作用，是一种较为理想的有机补硒产品。

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Synthesis and Antioxidant Activity of Selenium-Lycium Barbarum Polysaccharide

HAO Miao1，JIN Li-ming2，*，LIU Li-na3，XU Yong-bin2，MA Kun2，FAN Sheng-di2
（1.Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian 116021，Liaoning，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，Liaoning，China；3.Naval Medical Research Institute，Shanghai 200443，China）

Abstract：Sodium selenite and Lycium barbarum polysaccharide （LBP） were used to synthesize selenium-Lycium barbarum polysaccharide （SeLBP）in this experiment by chemical method.The content of selenium was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）and the result was 64.42 mg/g.SeLBP was characterized by visible ultraviolet （UV-VIS） and infrared （IR） techniques.The results proved the successful synthesis of SeLBP.The antioxidant activities in vitro of SeLBP was investigated by phenanthroline-Fe2+andpyrogallolautoxidationmethod.The resultsshowedthatinthe setting concentrationrange，the antioxidant activities increased with the elevation of concentration.The antioxidant activities of SeLBP were better than that of LBP.The clearance rates on superoxide anion radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 51.48%and 59.34%，respectively.The scavenging rates on hydroxyl radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 50.23%and 56.16%，respectively.This research was an important step as means of laying the foundation for further research on SeLBP as a low toxicity and effective organic selenium product.

Key words：selenium-Lycium barbarum polysaccharide （SeLBP）； synthesis； characterization； inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）；antioxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.004

国家自然科学基金（21172028）；辽宁省教育厅项目（L2013510）；中央高校基本科研业务费（DC110318）；海军医学研究所基金（12HY03）

郝苗（1976—），女（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品分析。

金黎明（1979—），女（朝鲜），副教授，博士，研究方向：生物活性物质。

2013-08-13