响应面分析法优化黄芩总黄酮提取工艺的研究*

钟金宝 王丽丽 王翌羽 谢荣辉 殷嫦嫦

(1九江学院基础医学院2011级本科生；2九江学院基础医学院 江西九江 332000；

3南昌大学研究生院医学部 江西南昌 330006)

响应面分析法优化黄芩总黄酮提取工艺的研究*

钟金宝1王丽丽2王翌羽1谢荣辉3殷嫦嫦2

(1九江学院基础医学院2011级本科生；2九江学院基础医学院 江西九江 332000；

3南昌大学研究生院医学部 江西南昌 330006)

目的优选超声波法提取黄芩总黄酮的工艺条件，为工业化生产黄芩总黄酮提供参考。方法采用超声波法提取黄芩总黄酮，对使用Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮进行方法学考察；选取乙醇浓度、液固比、提取时间3个影响因素进行Box- Benhnken中心组合设计，利用响应面分析法(RSM)对提取工艺参数进行优化。结果方法学考察结果表明本实验室采用Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮及超声提取工艺可靠；提取黄芩总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度60%，液固比40mL/g，提取时间45min；预测值为1.776%，实际得率为1.704%，两者吻合度较高。结论Box-Benhnken设计结合响应面分析法对黄芩总黄酮提取工艺进行优化既方便又快捷，得出的参数可信度高、实用性好。

黄芩，总黄酮，响应面分析法，提取

黄芩(Scutellariae baicalensis)为唇形科(Labiatae)植物，临床上用其干燥的根入药在国内外已有久远的历史，其性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]。黄芩的化学成分有黄酮类化合物，挥发油、萜类化合物、多糖、β-谷甾醇、苯甲酸、黄芩酶、黄芩苷、萜类和微量元素等已被证实[2]。随着黄芩化学成分和现代药理作用的深入研究，国内外学者发现黄芩中的黄酮类化合物，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等具有较强的抗肿瘤作用[3-5]，另外黄芩总黄酮还被证实有抗病毒和神经保护作用[6-7]。超声波提取法具有方便、节能、耗时短、得率高等特点[8]，利用此法结合乙醇作为提取溶剂提取黄芩总黄酮保证了黄酮的得率和纯度。因此目前常采用超声波辅助法提取黄芩总黄酮，但超声波辅助法提取黄芩总黄酮最优提取条件尚未完全清楚，本研究在方法学考察和单因素试验的基础上采用响应面分析法(RSM)[5]优化黄芩总黄酮超声提取工艺，探索黄芩总黄酮超声提取的最优条件，为高效提取黄芩总黄酮提供理论依据。

1 材料、仪器与方法

1.1材料

黄芩(Scutellariae baicalensis)购于九江市中医医院中药房，经九江学院基础医学院药学系的江和副教授鉴定为唇形科(Labiatae)植物黄芩根，60℃干燥，粉碎过80目筛备用；芦丁标准品购于上海金穗生物科技有限公司(批号20121102)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯试剂。

1.2 仪器

瑞利UV-2100型双光束紫外-可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器公司)；BT-2245型电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1最大吸收波长扫描和芦丁标准曲线制作 精确称取经120℃干燥至恒重的芦丁标准品10.0mg于50 mL容量瓶，加乙醇适量使其溶解，用乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成 0.20mg/mL的芦丁标准溶液。

精确量取2 mL标准品，按如下标准曲线的测定方法用UV-2100型双光束紫外-可见分光光度计在400～700 nm进行波长扫描以确定最大吸收波长。

分别精密量取0、1、2、3、4、5 mL芦丁标准品于25 mL容量瓶，加 5 %亚硝酸钠溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加 10 %硝酸铝溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加4%氢氧化钠溶液 5.0 mL，再加水定容至刻度，摇匀，放置 15 min。在最大吸收波长处测定吸光度，以浓度C和吸光度A进行线性回归，绘制标准曲线。

1.3.2黄芩总黄酮得率的计算 精密称取1 g黄芩样品，按实验设计好的条件进行超声提取，采用Al(NO3)3-NaNO2显色法，根据标准曲线，由吸光度A计算黄酮质量浓度C，则黄芩总黄酮得率Y计算公式为：Y=C×N×V×10-6/m。

C：黄酮质量浓度ug/mL

V：滤液体积 mL

m：样品质量g

N：稀释倍数

1.3.3方法学考察 按照1.3.2方法，对于实验采用的Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮分别进行精密度实验、稳定性实验、回收率实验对实验方法进行考察，并对超声提取工艺进行重复性考察。

1.3.4单因素实验 按照1.3.2方法，其他条件不变，分别考察乙醇浓度、液固比、提取时间对总黄酮得率的影响。

1.3.5响应面法优化实验 在方法学考察和单因素实验的基础上，以乙醇浓度、液固比、提取时间3个因素为考察因子，总黄酮得率Y为响应值用Design-expert软件设计3因素3水平(共17个试验点、5个中心点)的响应面实验，利用响应面结果确定黄芩总黄酮超声提取最佳工艺。

2 结果

2.1芦丁标准品的最大吸收波长与标准曲线

用UV-2100型双光束紫外-可见分光光度计在400 ～700 nm进行波长扫描，得出最大吸收波长为508.8 nm。在508.8 nm波长下测得芦丁线性回归方程为：A=0.0050+0.0106C (r2=0.9994)，芦丁标准曲线线性关系良好(见图1)。

图1 芦丁标准曲线

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验结果 精密称取样品1 g，按1.3.2方法提取，准确吸取6份续滤液于6个50 mL容量瓶，依次测定吸光度，计算相对标准偏差(RSD)。得出同一样品的吸光值的RSD为0.103%，表明其精密度良好，见表1。

表1 精密度实验

2.2.2稳定性实验结果 精密称取样品1 g，按1.3.2方法提取，分别在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h测定吸光度。由图2知样品液显色后，在2 h内，吸光度变化很小，说明黄芩总黄酮与铝盐形成的络合物显色稳定性好。

图2 稳定性实验

2.2.3回收率实验 称取6份约1 g重样品，按1.3.2方法提取，分别吸取1 mL滤液于25 mL容量瓶，分别测定其吸光度，其后另取6份滤液各加入5 mL芦丁标准溶液，依次测定吸光度，计算回收率。由表2知平均回收率为99.83%，说明Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩中黄酮类化合物准确度较高。

表2 回收率实验

2.2.4重复性提取黄酮实验结果 准确称取1g的样品4份，在相同条件下提取，按1.3.2方法提取，依次测定吸光度，计算相对标准偏差(RSD)。由表3知四次测得的吸光值RSD为0.171%，表明采用超声提取黄芩总黄酮重复性好。

表3 重复性实验

2.3单因素实验结果

2.3.1乙醇浓度对黄芩总黄酮得率的影响 在液固比为30 mL/g，提取时间为30 min的条件下，当乙醇浓度<60%时，黄酮得率随着乙醇浓度的增加而增大；当乙醇浓度为60%时，总黄酮得率最大；超过60%，得率反而下降，见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

2.3.2液固比对黄芩总黄酮得率的影响 在乙醇浓度为70%，提取时间为30 min时，随着液固比的增加，黄酮得率逐渐升高，当达到 40 mL/g 时，黄酮得率达到最大，再增加液料比，黄酮得率下降，见图4。

图4 液固比对总黄酮得率的影响

2.3.3提取时间对黄酮得率的影响 在乙醇浓度为70%，液固比为30 mL/g时，提取时间在 10 min 到 40 min 内，总黄酮得率呈上升趋势，然后随时间的延长逐渐下降(见图5)。

图5 提取时间对黄酮得率的影响

2.4 采用响应面法对黄芩总黄酮超声提取工艺的优化

2.4.1响应面分析因素与水平的选取 根据Box-Behnken 实验设计原理，选取乙醇浓度A、液固比B、提取时间C为影响总黄酮得率的因素，采用3因素3水平的响应面分析法，试验因素及水平设计(见表4)。

表4 响应面法的因素和水平

2.4.2 响应面分析方案及结果 根据实验方案进行试验，利用 Design-Expert 软件进行数据拟合，建立数学模型，响应面分析试验设计方案及结果，详见表5。

表5 响应面方案及实验结果

2.4.3模型的建立及其显著性检验 将得出的数据进行多项拟合回归，得到黄芩总黄酮得率Y与乙醇浓度A、液固比B、提取时间C的二次多项回归方程为：Y=1.74+0.10A-5.625E-0.03B+0.087C+0.075AB+0.074AC+0.017BC-0.24A2-0.037B2-0.13C2。

结合表6分析该模型知：模型失拟项(P=0.5741) 不显著，说明实验误差是影响回归方程失拟平方和的主要原因。方程的模型值p<0.000 1达极其显著水平，表明该模型用于评价实验结果的可信度高；Adeq Precision 测得值为20.523，说明模型分辨力高；变异系数低于10%，说明实验的稳定性良好。综合以上结果充分说明可以使用此模型来分析和预测超声波提取黄芩总黄酮的工艺。另外，一次项A、B的回归系数极其显著，即乙醇浓度和提取时间对总黄酮得率有极其显著的影响，交互项AB和AC的偏回归系数显著，说明乙醇浓度、液固比、提取时间的交互作用对总黄酮得率有显著影响。

表6 回归模型方差分析

2.4.4响应曲面结果 通过Design-Expert软件得出各影响因素及其交互作用的响应曲面和等高线图，根据响应曲面和等高线的性质分析所有相关图形，并结合多项拟合回归方程得知乙醇浓度与液固比，乙醇浓度和提取时间之间存在明显的交互效应，其他因素之间交互效应不明显。交互作用明显的两个响应曲面和等高线，见图6和图7。

图6 乙醇浓度和液固比交互作用对总黄酮得率影响的响应曲面和等高线图

图7 乙醇浓度与提取时间及其交互作用对总黄酮得率影响的响应曲面和等高线图

2.4.5提取工艺条件的确定及可靠性验证 通过 Design-Expert 软件求得黄芩总黄酮提取的最佳工艺条件如下; 乙醇浓度为63.33%、液固比43.65 mL/g、提取时间为44.41 min在此预测工艺条件下，黄芩总黄酮得率理论值为 1.776%。

为了保证实验结果的准确信，本实验做了3组平行实验来验证响应结果的可信度，同时考虑到实际操作的简便和节约资源，将验证实验的提取条件设为; 乙醇浓度为 60%，液固比40 mL/g，提取时间为 45 min，经过3 次重复验证性实验，计算出黄芩总黄酮平均得率为 1.704%，与理论值较接近，进一步说明利用响应面分析法优化黄芩总黄酮得出的提取工艺参数准确、可靠，可应用于实际生产操作。

3 讨论

超声波辅助法提取植物总黄酮是目前常用的方法，研究其对各种植物黄酮的最佳提取工艺具有重要的现实意义。为了得到客观的总黄酮得率数据，首先应通过方法学考察对实验室的检测系统进行评价。本研究采用Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮，方法学考察结果显示：精密度实验的RSD为0.103%，回收实验的平均回收率为99.83%，2 h内显色稳定。这些充分说明本实验室检测系统对Al(NO3)3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮的精密度及准确度较高，可用于测定黄芩总黄酮进而计算黄酮得率，为下一步的研究打下基础。此外本实验还考察了超声波辅助法提取黄芩总黄酮的重复性，取4份相同的标本进行提取，结果显示4次提取总黄酮得率差别较小，其RSD为0.171%，说明超声波辅助法提取黄芩总黄酮重复性较好，有利于单因素的研究。

在单因素研究过程中发现，总黄酮得率随着乙醇浓度的增大而呈上升趋势，当乙醇浓度接近60%时，得率最大。根据极性相似相溶原理，提取物与一定浓度溶剂相互混溶时，生物碱从植物细胞中溶出率高，即只有保证合适的乙醇浓度，才能有利于植物总黄酮从植物中高效析出。另外，溶液中适当水的存在会使植物材料吸水而膨胀，增大了植物细胞和溶液的接触面积，可以加快传质过程[10]。乙醇体积分数超过 60% 后，乙醇溶液极性减弱，导致对黄酮类化合物的溶解度相对减小，可能是因为一些弱极性的物质、醇溶性杂质、植物色素等大量杂质溶出，不利于黄酮类物质的溶出。通过响应曲面发现：总黄酮得率随着乙醇浓度和提取时间的增大而增大，两者交互作用效果显著；当乙醇浓度在一定的范围内，随着提取时间的延长有利于黄酮的充分扩散和析出。因此，适当延长提取时间有助于提高黄酮得率，但时间过长有可能导致黄酮的部分分解与转化使得率下降。

以往通常采用正交实验研究提取生物活性物的最佳工艺，但正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值[9]，响应面法克服了上述的缺陷，应用此分析方法研究总黄酮提取工艺条件，求得的回归方程具有较高的精确度，可很好地找到整个区域上各个因素的最佳组合和响应值的最优值，是比较理想的方法，也是近年来研究热点。 本研究采用超声提取法结合响应面分析法优化提取条件是一种新型有效的设计方法，它综合了超声提取和响应面法的优点，能准确、快速地得出提取工艺参数。有效降低了中药提取生物碱工艺条件的复杂程度、减少了实际工艺操作中存在的盲目性。本实验通过响应面图直观分析了各因素对黄芩总黄酮提取率的影响，以及因素之间的交互影响作用。得出最佳提取工艺为：乙醇浓度60%，液固比40 mL/g，提取时间45 min。

[1]王春民，刘刚，费艳，等.大孔吸附树脂法纯化黄芩总黄酮工艺的研究[J].中草药，2010，41(1)：0058.

[2]李堆淑.中药黄芩化学成分的研究进展[J].江西农业学报，2013，25(8)：51.

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[5]Guo Zhang Ma，Chun Hui Liu，Bin Wei，et al. Baicalein Inhibits DMBA/TPA-Induced Skin Tumorigenesis in Mice by Modulating Proliferation，Apoptosis，and Inflammation[J].Inflammation，2013，36(2)：457.

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[9]闫克玉，高远翔.响应面分析法优化槐米总黄酮的提取工艺[J].食品研究与开发，2009，30(7)：21.

(责任编辑胡安娜)

Study on Optimization of the Extraction Techniques of the Total Flavonoids from Scutellariae baicalensis Using Response Surface Methodology

ZHONG Jinbao1，WANG Lili2，WANG Yiyu1

XIE Ronghui3，YIN Changchang2

(1.Undergraduate School of Basic Medicine of JiuJiang University，JiuJiang, Jiangxi 332000，China；

2.School of Basic Medicine of Jiujiang University，JiuJiang, Jiangxi 332000，China；

3. Nanchang University Graduate School of Medicine，Nanchang, Jiangxi 330006，China)

ObjectiveOptimizing the ultrasonic extraction techniques of the total flavonoids from Scutellariae baicalensis，to provide a reference for industrial total flavonoids extraction of Scutellariae baicalensis.MethodUsing the ultrasonic method to extract total flavonoids in Scutellariae baicalensis; investigating the methodology of total flavonoids Scutellariae baicalensis measured by Al(NO3)3-NaNO2reaction；ethanol concentration, liquid-solid ratio and extracting time selected in Box-Benhnken central composite design；optimizing extraction process parameters by using the response surface method (RSM).ResultThe methodological evaluation showed that it was reliable to measure the total flavonoids by Al(NO3)3-NaNO2reaction and the ultrasonic extraction technology in this laboratory；The optimum technical condition in extracting total flavonoids of Scutellariae baicalensis; ethanol concentration 60%, liquid-solid ratio 40 mL/g，extraction time 45 minutes. The predictive value was 1.776% and the yield of the total flavonoids was actually 1.704%，and both results were in good agreement.ConclusionBox-Benhnken design combined with response surface method was convenient and reliable for extracting total flavonoids from Scutellariae baicalensis. The optimal extraction parameters was of reliability and practicality.

scutellariae baicalensis, total flavonoids, response surface analysis(RSA), extraction

国家自然科学基金计划项目(编号81160536)成果之一。

2014-5-26

殷嫦嫦，博士，教授，南昌大学硕士生导师，研究方向为分子生物学与临床生物化学。E-mail：yinchangchang112@163.com

R 284.2

A

1674-9545(2014)03-0069-(06)