大鼠外伤性视神经病变后GAP-43表达的变化

刘晓坤 罗钢 赵平

·论著·

大鼠外伤性视神经病变后GAP-43表达的变化

刘晓坤 罗钢 赵平

目的研究大鼠视神经夹挫伤后视神经和视网膜神经节细胞(retinal gangliocytes，RGCs)形态学及生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)表达的变化。方法采用大鼠球后视神经钳夹伤模型，分别于损伤后1、4、7、14、28d处死动物，HE染色观察视神经组织及RGCs的动态改变，免疫组化方法检测视神经轴突GAP-43的表达变化。结果视神经损伤后，RGCs数目明显下降，14d内降低速度较快，14d后下降速度减慢；与正常大鼠视神经轴突相比，GAP-43表达明显增加，伤后14d达峰值，14d后逐渐下降(P<0.05)。结论视神经损伤后RGCs数量减少是其视功能下降的病理基础之一，视神经轴突GAP-43表达增加是视神经损伤修复的一种表现。

外伤性视神经病变；视网膜神经节细胞；生长相关蛋白

外伤性视神经病变是临床上常见的致盲性眼病。视神经由RGCs的轴突组成，为中枢神经系统的一部分。一系列的动物模型研究证实视神经损伤后视功能下降的病理基础是以RGCs的继发性丧失为主的。GAP-43是一种神经特异性的质膜磷酸蛋白，广泛分布于生长、发育中的胚胎神经系统中。神经系统发育成熟后其表达水平变得很低甚至消失，于神经系统损伤后的修复再生过程中重新表达，被认为是神经生长发育和再生的分子标记物[1，2]。本实验通过建立大鼠视神经夹挫伤模型，观察伤后视神经、RGCs的形态学变化及视神经轴突中GAP-43的变化，为研究视神经损伤后变化规律及视神经损伤的再生修复提供了分子病理学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用清洁级健康成年Sprague-Dawley大鼠36只(36眼)，雌性，体重230～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供。健康无眼疾，实验期间由河北医科大学第三医院动物实验中心代养。随机分为正常组(6只6眼)，损伤组(30只30眼)。损伤组再按损伤后存活的时间随机分为1、4、7、14d和28d 5组，每组6只。每只动物左眼为实验眼，右眼为假伤眼。

1.2 视神经损伤动物模型制作 腹腔注射6 g/L戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉。固定于俯卧位。沿角膜缘剪开鼻侧球结膜，分离并暴露视神经。于球后2 mm处用压力恒定的反向镊夹持视神经，致伤时间分别为20 s，同时观察大鼠眼底血液供应情况，避免损伤眼动脉。注意反向镊尖与视神经的长轴垂直。松开反向镊后，缝合球结膜。致伤眼直接对光反应消失，瞳孔散大固定；检眼镜观察眼底，视网膜血管无出血与梗塞者为成功制作之动物模型，术后结膜囊内涂红霉素眼膏。

1.3 取材 正常对照组于损伤后4d取材，损伤组分别于损伤后1、4、7、14d和28d 5个时间点取材。6 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(60 mg/kg)，开胸，经左心室插管，灌注0.9%氯化钠溶液，冲净血液，再灌注4℃ 40 g/L的多聚甲醛磷酸缓冲液250 ml，先快后慢，持续30 min。去除眶外侧和眶上侧骨壁，取大鼠眼球和视神经(直至视交叉处，以判断损伤远近端)。

1.4 视神经与视网膜光镜切片的制备 40 g/L多聚甲醛固定，依次梯度乙醇脱水、透明、包埋，冠状面4 μm连续切片。常规HE染色。光学显微镜下观察视神经和视网膜的形态学改变。在Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数(200 倍)下，每个标本计数 3 张切片，每个切片计数 3 个视野。

1.5 免疫组织化学检查 GAP-43免疫组化染色严格按照SP试剂盒说明操作。每组每个时间点分别选取6张切片，采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，统一的放大倍数，随机检测3个区域(150 μm×200 μm)平均光密度值(average opticaldensity，AOD)。每标本数据取其均值。

2 结果

2.1 HE染色的视网膜切片形态学观察和 RGCs 计数

2.1.1 正常组：视网膜层次清晰，神经纤维层嗜伊红性红染，RGCs 呈单层排列，胞核较大，大小不一，呈圆形或椭圆形，染色较浓，排列整齐；内核层胞核较大，染色较深，外核层胞核较小，染色深，排列较紧密。

2.1.2 损伤组：1、4d同正常组相比视网膜形态无明显改变；7d时，神经纤维层变薄，内核层及外核层变薄，细胞的数目减少，排列紊乱，RGC 层部分胞核体积缩小，染色加深，呈核固缩形态；14d时上述病理改变加重；28d时，RGC 层排列明显稀疏，数目减少明显，较多细胞核体积缩小，染色加深，呈核固缩形态，神经纤维层变薄，内核层及外核层明显变薄，细胞排列紊乱。

2.1.3 RGCs计数：1、4d时，2组 RGCs 个数的差异无统计学意义(P>0.05)；4d后损伤组RGCS数目呈下降趋势，7、14、28d与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组大鼠RGCs计数

组别RGCs计数正常组30.5±2.1损伤组 1d30.2±2.1 4d29.5±2.1 7d18.4±2.3* 14d13.2±2.1* 28d10.2±1.4*

注：与正常组比较，*P<0.05

2.2 HE 染色的视神经切片形态学观察

2.2.1 正常组：视神经：横切面类似圆形，神经纤维束排列均匀呈柱形，神经纤维排列整齐，散在胶质细胞，无炎性细胞浸润及组织的水肿、坏死，染色均匀。

2.2.2 损伤组：1d视神经纤维束肿胀，散在的神经纤维空泡样变性；4d视神经纤维束肿胀加重，神经纤维可见空泡样变性，细胞水肿，少数细胞核出现固缩；7d视神经纤维束肿胀，可见片状神经纤维空泡样变性，细胞明显水肿，部分细胞核固缩；14d视神经纤维束肿胀，可见大片神经纤维空泡样变性，形成大空泡，细胞明显水肿，较多的细胞核固缩；28d视神经纤维束肿胀稍减轻，大片神经纤维空泡样变性，大空泡较多，细胞水肿较前减轻，较多细胞核固缩。

2.3 GAP-43 免疫组化 免疫组化结果判断：(-)无着色；(+)浅黄色；(++)黄色；(+++)深黄色；(++++)深棕黄色。

2.3.1 正常组免疫组化(-)。

2.3.2 损伤组：1d时损伤近端及远端GAP-43 蛋白表达均不明显，无着色(-)；4d，7d时损伤近端 GAP-43 蛋白表达阳性，均呈黄色(++)，远端(-)；14d时损伤近端 GAP-43 表达阳性减弱，呈浅黄色(+)，损伤远端局灶性阳性表达，呈黄色(++)；28d时损伤近端及远端GAP-43 蛋白表达微弱，呈浅黄色(+)。

2.3.3 大鼠视神经损伤后4d、7d、14d、28d时GAP-43蛋白表达：平均光密度分别为：(0.0198±0.0020)、(0.0890±0.0180)、(0.2761±0.0281)、(0.2112±0.0331)。

3 讨论

视神经损伤多导致严重视功能障碍甚至永久失明。Walsh[3]二次损伤学说认为视神经损伤可分为原发性损伤和继发性损伤，是目前较为公认的外伤性视神经损伤机制。实验研究及临床观察认为，眼外伤后10 min内出现的视敏度下降或视力丧失为原发性损伤，而数十分钟、数小时或数日后出现的视力损害为继发性损伤，视神经缺血和水肿相互加重使有恢复潜能的神经元进一步丧失。本实验观察到，视神经损伤在光镜下的主要表现为神经纤维空泡样变性和视神经纤维束的肿胀，随着时间推移呈不同程度的交错变化过程。神经纤维束的肿胀造成视神经管内的视神经受压并加重视神经损伤。视神经局部损伤合并缺血缺氧，造成局部能量代谢障碍，ATP 含量减少，使视神经的通透性和组织液含量增加，从而造成轴突的肿胀以及髓鞘的松解。轴突变性和髓鞘脱失造成视功能的进一步丧失，使视力障碍变为不可逆。所以通过药物或手术等干预措施保护原发性损害后尚存活的神经元，防止或减少继发性损害，保持残余视力并促进视力恢复，是治疗视神经损伤的目的。

本实验观察到伤后7d，损伤组可见 RGCs 层部分胞核体积缩小，染色加深，呈核固缩形态，视神经纤维层变薄，内核层及外核层变薄，细胞排列紊乱。伤后 14、28d，损伤组神经纤维层，内核层及外核层明显变薄，仍可见核固缩改变。统计分析结果显示视神经损伤后的 RGCs 数是一个逐渐下降的过程。随着伤后时间的延长RGCs数目明显减少，伤后7d，RGCs退变死亡速度加快，伤后7～14d RGCs 密度减少最明显，到14d至28d RGCs 减少较前稍趋缓和。提示在视神经外伤后，RGCs的丧失与时间有明显相关性。与蔡莉等[4]兔视神经挫伤的病理研究结果相似。出现这一结果的原因，可能是由于伤后2周内以原发性损伤为主，而2周以后则是继发性损伤起主要作用，而原发性损伤已不明显。

视神经纤维与RGCs 两者之间变化基本一致，但是视神经纤维损伤变化出现相对于 RGCs 早。损伤4d光镜下视神经纤维数目就有明显差异，而RGCs 在7d后才见差别。提示视神经损伤后神经纤维较 RGCs 的变化早，可能为视神经损伤后轴突仍有少量靶细胞分泌的逆行性神经营养因子，延缓了RGCs 的死亡，待神经营养因子消耗殆尽后，RGCs 就会大量死亡，这也与本实验中观察到7d时 RGCs 加速死亡一致。

GAP-43 是一种神经特异性的质膜磷酸蛋白，广泛存在于胚胎神经系统中，特别是在轴突末端含量极高，一旦神经系统发育成熟，GAP-43 的表达水平迅速下降甚至消失，但会神经系统损伤后的修复再生过程中重新表达。GAP-43蛋白的合成与表达直接与轴突生长能力呈正相关，可以代表轴突生长能力，被认为是神经生长发育和再生的分子标记物[5，6]。现已认为GAP-43的表达增高是神经系统尤其是中枢神经系统再生的一个特征[7-10]。越来越多研究报道表明 GAP-43与视神经损伤及再生密切相关，损伤蟾蛛视神经纤维，其RGCs内的 GAP-43在损伤后第4天开始升高，14d达到高峰，到21d视神经长入靶组织后，GAP-43的水平开始逐渐下降。大鼠视神经切断后坐骨神经段吻合，玻璃体腔内同时植入坐骨神经段，伤后3d RGCs 就出现了GAP-43的阳性表达并可持续到8周。以上研究表明 GAP-43是视神经再生的特征性的证据。本实验结果显示视神经损伤后7d损伤近端GAP-43有强阳性表达，此为视神经对损伤的反应。视神经轴突受损伤后，启动了一系列RGCs胞体的反应，包括核质的增加，核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)及蛋白合成的启动等，伴随有轴突生芽而引发的 GAP-43的重新表达，在再生中起十分重要的作用。损伤造成了视神经生存环境和正常生理结构的破坏，这便刺激了GAP-43在损伤早期的高表达，而后者立即成为引发修复再生反应的始动因素，也可以说为视神经以后再生打下了物质基础。

本实验结果提示视神经损伤至 RGCs 大量死亡之间存在着间期，GAP-43蛋白表达水平也表现出一定的时间相关性。在此期间如能够给予及时有效的治疗，抢救原发损伤后存留的神经元，防止及减少继发性损害，减少死亡细胞数目，促进视神经轴突的再生，使其恢复正常结构功能，最终促使视神经功能的恢复。因此早期治疗是影响视神经损伤治疗预后的一个重要因素。

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2 Kaneda M，Nagashima M，Nunome T，et al.Changes of phospho-growth-associated protein 43(phospho-GAP43) in the zebrafish retina after optic nerve injury: a long-term observation.Neurosci Res，2008，61:281-288.

3 Walsh FB.Pathological-clinic correlations.Indirect trama to the optic nerves and chiasm.11.Certain cerebral involvement associated withdefective blood supply.Invest Ophthalmo，1966，5:433-449.

4 蔡莉，惠延年，马吉献，等.兔视神经挫伤的实验研究.眼外伤职业眼病杂志，2000，22:125-126.

5 Dinocourt C，Gallagher SE，Thompson SM.Injury-induced axonal sproutingin the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors.Eur J Neurosci，2006，24:1857-1861.

6 Stroemer RP，Kent TA，Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting，synaptogenesis，and behavioral recovery after neocortical infarction in rats.Stroke，1995，26:2135-2144.

7 Shen Y，Meiri K.GAP-43dependencydefinesdistinct effects of netrin-1 on cortical and spinal neurite outgrowth anddirectional guidance.Int Jdev Neurosci，2013，31:11-20.

8 Allegra Mascaro AL，Cesare P，Sacconi L，et al.In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110:10824-10829.

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ThechangesofGAP-43inratswithtraumaticopticneuropathy

LIUXiaokun，LUOGang，ZHAOPing.DepartmentofOphthalmology，TheThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China

ObjectiveTo observe the changes in morphology of optic nerve and retinal gangliocytes(RGCs) as well as the expression levels of growth associated protein-43 (GAP-43) in rats with optic nerve contusion.MethodsIntraorbital optic nerve contusion models in rats were established，and the animals were executed at.1，4，7，14 and 28days after injury.The morphological changes in optic nerve tissue and RGCs were observed through HE staining.The expression levels of GAP-43 in optic nerve axons weredetected by immunohistochemistry.ResultsThe number of RGCs was reduced significantly after optic nerve injury，and the speed of reduction was quicker within 14days.As compared with those in normal optic nerve axon，the expression levels of GAP-43 were significantly increased in injury group，which peaked at 14days after injury and graduallydecreased after14days.ConclusionThedecrease of RGCs number after optic nerve injury is one of the pathological mechanisms of visual function lesion.The increase of GAP-43 expression in the optic nerve axons is a kind of injury repairing phenomenon.

traumatic optic neuropathy；retinal gangliocytes；growth associated protein-43

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.17.002

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20110404)

050051 石家庄市，河北医科大学第三医院眼科

R 774

A

1002-7386(2014)17-2568-03

2014-02-11)