转Bt基因糙米对断奶仔猪潜在致敏性的安全评价

曹正辉，王占彬，顾宪红

(1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，100193；2.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)

转Bt基因糙米对断奶仔猪潜在致敏性的安全评价

曹正辉1,2，王占彬2，顾宪红1*

(1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，100193；2.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)

试验旨在研究转Bt(bacillus thuringiensis)基因糙米对断奶仔猪的致敏性。选用30头21日龄的“大×白”断奶仔猪，随机分为2组，对照组日粮中添加70%的亲本非转基因糙米，试验组日粮中添加70%的转Bt基因糙米，试验期30 d。在试验第7 d和28 d采血，试验第25 d利用Bt基因在水稻中表达的Cry1Ac杀虫蛋白的标准品进行仔猪的皮肤试敏试验。结果表明，对两组糙米的氨基酸水平进行了检测和对比分析，发现两组糙米的氨基酸水平差异不显著(P>0.05)；通过对仔猪血清免疫球蛋白E、组织胺含量；血浆中二胺氧化酶活性及D-乳酸含量；唾液皮质醇含量等的检测，结果显示两组间这五个指标均差异不显著(P>0.05)；利用Cry1Ac的蛋白标准品对仔猪进行的皮肤试敏试验，结果显示两组均无红斑产生。由试验结果可见，在本试验条件下，转Bt基因的糙米对仔猪无明显的致敏性。

Bt基因；糙米;Cry1AC；致敏性

转基因作物在全球的种植量逐年攀升，转基因产品的市场份额也逐渐提高，由此引发的转基因食品的食用安全问题也越来越广泛的受到关注[1]。目前对于转基因产品的安全评价的主要侧重于两个方面：一方面是转基因作物对周围环境的安全性，另一方面是食品的食用安全性。其中，转基因食品的食用安全是转基因作物安全评价问题的焦点。Nordlee等[2]的研究报道，转入巴西坚果后的大豆可诱发对巴西坚果过敏的人发生过敏反应；2012年Tang等以中国儿童为试验对象进行的“黄金大米”营养学评价事件等[3-4],引起了人们的足够重视。因此，评价转基因作物的潜在致敏性安全评价成为了转基因作物安全评价的重要内容之一。

大米作为世界上三分之一人口的主粮，每年因为病虫害损失数亿美元[5]。由于病虫害问题，人们加大了化工农业的使用，这样不仅增加了生产的投入成本同时也造成了农药残留问题造成了生态系统的紊乱。转Bt基因抗虫水稻就是通过基因工程技术将苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,Bt)内毒素晶体蛋白基因-Cry1Ac基因导入到水稻基因组中获得具有抗鳞翅目昆虫特性的转基因生物新品种。目前，关于转Bt基因抗虫水稻潜在致敏方面的研究鲜少报道，尤其是以仔猪为动物模型的试验。由于仔猪的消化生理和免疫反应等方面与人类有极大相似性，因此，选择断奶仔猪为研究对象，对转Bt基因糙米是否具有潜在致敏性进行安全评价，从而指导转基因水稻在食品生产上的应用提供可靠的依据。因此，对完善转Bt基因稻米的安全性评价体系具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验中转Bt基因的水稻(浙优5号)是由浙大208S×非转基因ZR9两系杂交所得的抗虫新品种；对照品种是扬两优6号，为浙优5号的亲本非转基因品种。两个品种水稻均由华中农业大学提供；豆粕和豆油由黑龙江九三粮油工业集团有限公司提供的“九三牌”非转基因大豆粕和大豆油。皮肤试敏试验时使用的Cry1AC蛋白标准品购于北京科美信达科技有限公司。

1.2 糙米成分的测定

日粮中两种糙米的氨基酸、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪等含量由动物营养学国家重点实验室按照国标方法分别测定。糙米中Cry1AC杀虫晶体蛋白含量由中国农业科学院植物保护研究所检测。

1.3 动物饲养

30头21日龄断奶仔猪由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验猪场提供，使用MLP测定站饲喂，整个饲养过程中猪只自由采食和饮水。试验期猪舍温度为19～22 ℃，湿度为61%～72%。

1.4 日粮组成

试验日粮参照中华人民共和国农业行业标准：NY/T 65-2004《猪饲养标准》[6]猪的营养需要，根据测定的糙米中各种营养成分含量配制糙米豆粕型日粮，日粮组成及营养水平见表1。日粮中的其他原料均为非转基因产品，日粮以粉料形式饲喂。

表1 试验日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Ingredients and nutrient levels of the experimental diets(air dry basis)

注：①预混料可为每千克日粮提供：叶酸 0.03 g；维生素B127.4 μg；维生素E 10.6 IU；泛酸 7.5 mg；维生素A 1 370 IU；维生素D3155 IU；维生素K30.5 mg；核黄素 2.29 mg；胆碱 0.3 g；铁 55.6 mg;铜 3.8 mg；锌 56.0;锰 2.15 mg；硒 0.18 mg；碘 0.14 mg。②粗蛋白、粗脂肪为实测值、其他为计算值。

Note:①Premix provided the fllowing per kg of diets: folic acid,0.03g;V B127.4μg;V E 10.6 IU;pantothenic acid 7.5 mg;V A 1 370 IU;V D3155 IU;V K30.5 mg;riboflavin 2.29 mg;choline 0.3 g;iron 55.6 mg;copper 3.8 mg;zinc 56.0;manganese 2.15mg;selenium 0.18 mg;iodine 0.14mg.②Crude protein,crude fat were analyzed values,others were calculated.

1.5 试验设计

将30头大白仔猪随机分为两个处理：试验组饲喂转Bt基因的糙米日粮，对照组饲喂非转基因的糙米日粮，每组15头，每个重复1头猪，试验期30 d。两组于试验第7 d、28 d 9∶00点，采用自制的唾液采集器无抓捕采集唾液，每圈采集6头试猪，用于测定皮质醇浓度；10∶00点进行前腔静脉采血，每头采血2管，一管进行离心收集血清，用于血清免疫球蛋白IgE以及血清组织胺含量的检测。另外一管进行抗凝处理，用于检测D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)含量。第25 d进行皮肤试敏试验。

1.6 样品的采集和制备

1.6.1 唾液皮质醇的检测 试验第7 d和28 d的上午9∶00 ，采用唾液采集器(铁丝缠上纱布条)无抓捕采集仔猪的唾液，将纱布悬挂于猪圈上方，供仔猪自由咀嚼，当纱布完全浸湿后用剪刀剪下纱布，置于注射器中挤出唾液样品，置于离心管中，离心处理。冻离心机0 ℃离心15～20 min(4 000 r/min),取上清液，-80 ℃保存，用于唾液皮质醇的检测，由北京莱博泰瑞科技公司采用放射免疫法分析。

1.6.2 血清免疫球蛋白IgG、IgA以及血清组织胺含量的检测 试验的7 d和28 d的上午10∶00，用注射器从前腔静脉采血5 mL，肝素抗凝处理，用于D-乳酸和DAO含量的检测。另采血5 mL，不抗凝，室温倾斜放置30 min，3 000 rpm离心10 min，取血清用以血清免疫球蛋白IgG、IgA以及血清组织胺含量的检测。

1.6.3 皮肤试敏 试验的第25 d进行皮肤致敏反应试验。在试验的前一天用动物专用剃毛剪小心备皮，暴露出腹部白色皮肤，用油性记号笔画出皮试的范围并分区和标记。试验开始后，各组仔猪分别腹部标记区域皮下注射含有Cry1Ac纯品蛋白的生理盐水溶液，注射剂量为0.5 mg/头，对照组的仔猪在标记区域注射等量的生理盐水。在注射30 min后，观察并测量注射部位皮肤上的红斑数量和大小，若大于5 mm，认为发生了皮肤过敏反应。

1.7 数据统计分析

本试验数据采用SAS9.2统计软件进行处理，采用ANOVA程序对数据进行t检验分析。结果均用“平均值±标准差(mean±SD)”表示。以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果和分析

2.1 转Bt基因糙米与亲本非转基因糙米中氨基酸含量的对比

对转Bt基因糙米和亲本非转基因糙米进行营养成分对比分析，外观来看，两组大米均外观均细长饱满且均匀，两者也均无异常气味。转Bt基因糙米和对照组亲本糙米的主要营养成分含量见表2。关于转基因糙米中晶体杀虫蛋白(cry1Ac)含量检测，发现在转Bt基因组糙米中cry1Ac的含量为0.25 μg/g，在对照组的非转基因亲本糙米中没有检测到杀虫晶体蛋白。两组数据均为均值(n=3)，可以看到转基因糙米和对照组糙米营养成分相似，除晶体杀虫蛋白(cry1Ac)外，其余成分均没有明显的差别。

表2 转Bt基因糙米与亲本非转基因糙米中的营养成分含量Table 2 The amino acid compositions in GM and parental rice

2.2 转Bt基因糙米对仔猪血清免疫球蛋白IgE、血清组织胺以及唾液皮质醇含量的影响

饲喂转Bt基因糙米后的断奶仔猪的血清中IgE、血清组织胺含量如表3所示，两组间差异不显著(P>0.05)，唾液皮质醇含量两组间也无显著差异(P>0.05)。

表3 转Bt基因糙米对仔猪血液和唾液指标的影响Table 3 Effect of transgenic Bt rice on blood and saliva indexes in piglets

2.3 转Bt基因糙米组与亲本非转基因糙米组仔猪血液中D-乳酸和二胺氧化酶含量对比

通过对转Bt基因组和对照组仔猪血浆中D-乳酸和二胺氧比酶(DAO)进行分析检测，如图1所示，两组间D-乳酸和DAO含量均无显著差异，且试验组的含量略低于对照组，说明进入血液中的D-乳酸和DAO量转基因组少于对照组，表明转Bt基因糙米对仔猪的肠道没有造成损伤且肠壁更健康。

2.4 转Bt基因糙米组与亲本非转基因糙米组仔猪皮肤致敏试验结果对比

如图2可见，在皮肤试敏30 min后，对皮肤注射点进行拍照观察，进行评分，结果显示两组仔猪皮肤均未见红斑，无明显反应。

图1 转Bt基因糙米对仔猪肠道粘膜损伤的比较Fig.1 Comparison of Bt transgenic rice on the intestinal mucosal injury

图2 仔猪皮肤致敏试验结果a.对照组(亲本非转基因糙米组)；b.处理组(转基因糙米组)Fig.1 Results of skin prick test in pigletsa.Control group;b.treatment group

3 讨 论

3.1 转Bt基因糙米营养成分含量对比

世界经济合作组织于1993年首次提出关于转基因食品安全评价的方法-实质等同原则。其具体内容就是将转基因食品与非转基因的传统食品的营养成分进行分析比较，如果转基因食品与传统的非转基因食品具有实质等同原则，就被认为是具有营养安全性。Sidu[7]、Aulrich[8]和Chenkova[9]等分别对抗草甘膦的转基因玉米中的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、淀粉、粗脂肪、氨基酸和常量元素等的分析表明了抗草甘膦的转基因玉米与非转基因玉米实质等同。对于转Bt基因的作物，Reuter[10]转Bt基因的玉米中粗蛋白、淀粉、糖、非淀粉多糖、氨基酸、脂肪酸及一些金属元素与传统玉米无显著差异。Cao等[11]对转Bt Cry1c基因水稻T1c-19和亲本大米明恢63的营养成分进行了比较，发现转基因大米与亲本大米的营养成分相似。这也与本试验的结果一致，本试验对转Bt基因的糙米与其亲本的非转基因糙米的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸水平等进行了检测分析，结果显示两组间的营养物质成分相似，无显著差异，同样符合实质等同原则。

3.2 转Bt基因糙米对断奶仔猪的致敏结果分析

食物过敏症是指幼儿期动物的常见疾病，主要以速发型的I型变态过敏反应为主。目前IgE成为了几乎所有动物模型致敏模的标志性指标[12-13]。食物过敏反应基本上都是通过IgE介导的速发型过敏反应，介导皮肤的过敏反应。大量的研究报道指出，在人和动物发生食物过敏的反应过程中，能够产生大量的IgE抗体，发生特异性的体液免疫反应[14-16]。产生的IgE抗体能够迅速和小肠及其组织细胞上的亲和力高的FcεRI受体结合，然后激活小肠肥大细胞，使其脱粒释放组织胺、5-羟色胺及细胞因子等活性物质，进一步导致机体发生超敏反应。之前也有研究发现，人类和动物在受到过敏原发生过敏反应时，产生的抗体也略有不同，如人类和大多数动物在发生变态反应时主要是由IgE抗体进行介导的抗原特异性。但有些动物在发生过敏反应和速发型变态反应时则是由IgE和IgG1抗体的抗原特异性进行介导。近年来，人们真的大豆蛋白作物食物致敏原引起任何动物的过敏反应做了大量的试验研究，其过敏反应临床表现为恶心、呕吐、腹泻、哮喘、荨麻疹、过敏性皮炎、胃肠道损伤等[17],由于仔猪的消化生理和免疫反应等方面与人类有极大相似性，因此，目前仔猪成为了生物医学研究人类过敏机理发生的一种重要的动物模型[18]。贾旭东等[19]利用BN大鼠为动物模型，对转入抗虫基因CpTI及选择标记基因HPT的S86大米的致敏性进行了研究。大鼠在饲养六周后，S86大米饲料没有激发大鼠体内的IgE和IgG反应，组胺水平与阴性对照组无显著差异(P>0.05)，也没引起大鼠血压方面的变化，表明了转基因大米S86未对大鼠产生致敏性。之后，孙艳波等[20]利用用转Bar基因水稻和亲本非转基因水稻饲喂小鼠90 d，持续3代，期间小鼠均未出现明显的致敏反应症状，肠道粘液免疫球蛋白A(sIgA)、血清DAO和血清免疫球蛋白E(IgE)水平均无显著性差异。Shim和利用转基因大豆CP4EPSPS进行饲喂试验，显示转基因大豆CP4EPSPS对动物体没有致敏性[21]。对于转基因大米的致敏研究方面，Domon等[22]利用转基因水稻7Crp饲喂短尾猴，然后经口灌胃后，无不良影响，未发现对试验受试动物的健康有不利影响，同样证明转基因水稻7Crp具有食用安全性。本试验同样是利用转Bt基因的糙米和非转基因的亲本糙米饲喂断奶仔猪30 d，从结果来看，仔猪唾液皮质醇、免疫球蛋白E(IgE) 、组织胺含量、血清二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸等的检测，结果显示两组间这五个指标均无显著差异(P>0.05)，表明了转Bt基因糙米未对仔猪造成过敏反应。

3.3 转Bt基因糙米对仔猪消化道的损伤

消化道粘膜损伤临床上通常使用肠粘膜通透性、肠粘膜pH、DAO活性和血浆内毒素检测等方法进行测定。本试验采用血浆D-乳酸和DAO两个肠道通透性的重要指标进行检测。

D-乳酸是细菌的发酵代谢产物，肠道中的诸多细菌均可产生，在哺乳动物体内不具备能够将其迅速分解的酶系统。由于肠壁缺血等原因导致肠道粘膜损伤，进而肠粘膜细胞间紧密关联性遭到破坏，肠壁的通透性增加后，肠道中的D-乳酸就会通过受伤肠壁入血，故检测血中的D-乳酸含量可直接反映肠粘膜的受伤程度和肠道通透性的变化情况。动物试验表明急性的肠缺血损伤导致血中的D-乳酸浓度迅速升高，肠粘膜的损伤评分值与血浆中D-乳酸的含量呈显著的正相关。孙晓庆等[23]的研究表明了血浆中的D-乳酸和内毒素的浓度变化有很好的相关性，且都与小肠肠壁的病理结果一致。与内毒素相比，血浆D-乳酸的样本采集、结果显示、检测等更为方便易行。因此血浆D-乳酸可作为肠道屏蔽功能障碍、肠道通透性增加的预警指标。

二胺氧化酶主要存在于哺乳动物体粘膜和绒毛上层，它可以氧化腐胺成为氨基丁醛，进一步环化成为高度活性的-吡咯啉，其活性与绒毛高度计粘膜细胞核酸蛋白质密切相关。是反映小肠粘膜结构和功能性的重要指标。目前，大多是通过分光光度计和放射活性测定法来检测DAO含量。分光光度计法交放射活性法更为简便、经济快速、重复性好，在临床上应用较多。本试验选用了D-乳酸和DAO两个指标来对转Bt基因糙米对仔猪消化道损伤进行了评价，结果显示，两组间的两个指标间无显著差异(P>0.05)。且试验组的D-乳酸和DAO含量均略低于对照组。表明了相比对照组，转Bt基因糙米未断奶仔猪的消化道造成损伤。

4 结 论

本试验结果表明，在断奶仔猪日粮中添加70%的转Bt基因糙米作为能量饲料，试验结果显示转Bt基因糙米没有对断奶仔猪造成过敏反应，也未对仔猪的肠道粘膜和免疫系统造成损伤。

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TheSafetyEvaluationofTransgenicBtBrownRiceonPotentialAllergencityofWeaningPiglets

CAO Zheng-hui1,2，WANG Zhan-bin2，GU Xian-hong1*

(1.ChineseAcademyofAgriculturalSciences,InstituteofAnimalSciences,StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，Beijing100193,China;2.HenanUniversityofScienceandTechnology,CollegeofAnimalScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003,China)

The experiment aimed to study the effect of transgenic Bt brown rice on allergencity of weaning piglets.Nutrient contents of transgenic Bt brown rice and non-transgenic parental brown rice were analyzed and compared.The diet was formulated based their nutrient contents.Thirty Large White×Danish Landrace weaning piglets at 21-d-old were selected and divided into two groups randomly (each group consisted of fifteen piglets and every piglets meant one repeat).The control group diet was comprised of 70% non-transgenic parental brown rice and the experimental group was comprised of 70% transgenic brown rice.The experiment period was 30d.Saliva and the vena cava blood were collected on 7 d and 28 d in the experimental period,respectively.Skin sensitive test of piglets was conducted on 25 d with standard substance of Cry1Ac which was expressed in rice by Bt.Amino acid level of two groups was analyzed and compared.The result showed that amino acid level was similar and had no significant difference (P>0.05).IgE and histamine content in serum,DAO activity and D-lactate content in plasma and Saliva cortisol content were analyzed.The result showed that these five indicators had no significant difference(P>0.05);The result of skin prickre actions test of Bt Cry1Ac protein on weaned piglets showed that no spiloplaxia was doserved in both groups.To conclusion,Transgenic Bt brown rice had no significant allergencity on piglets in this experiment.

Bt gene;brown rice;Cry1Ac;allergenicity

2013-11-06，

2013-12-03

转基因生物新品种培育重大专项课题(2012ZX08011001)

曹正辉(1987-)，男，河南新乡人，硕士，主要从事营养生态学研究。E-mail: caozh0903@163.com

*[通讯作者]顾宪红(1966-)，女，江苏通州人，研究员，博士生导师，主要从事畜禽应激、福利与健康养殖研究。E-mail: guxianhong@vip.sina.com

S811.6

A

1005-5228(2014)03-0032-06