混合型肝癌组织中OV6与Snail蛋白的表达及临床意义

张旭光, 王 杰, 李 权, 吴 东

(1. 苏州大学研究生院, 江苏 苏州, 215006; 2. 东方肝胆外科医院, 上海, 200438)

混合型肝癌(cHCC-CC)在原发肝癌中是一个罕见的病理亚型，约占总发病人数1.5%[1-2]。虽然相对罕见，但由于其独特的临床病理学特征而吸引了广泛关注。OV6作为肝祖细胞的标记物，能够增加肿瘤的化疗耐药性[3]。Snail是一种含有锌指结构的转录抑制因子，同时也是上皮间质转化(EMT)的重要调节因子，能够促进肿瘤的侵袭与转移。本研究采用免疫组织化学法检测OV6和Snail蛋白在混合型肝癌组织中的表达，探讨其与混合型肝癌发生发展的关系及临床病理学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取1997年2月—2003年7月在本院确诊为混合型肝癌并进行根治性切除的患者70例，其中男63例，女7例，平均年龄48.1岁；乙肝表面抗原(HBsAg)阳性58例(82.8%), 阴性12例(17.2%); 肿瘤平均直径为6.1 cm。标本均经甲醛固定、石蜡包埋和4 μm厚连续切片。鼠抗人OV6单克隆抗体购于R﹠D公司，兔抗人Snail多克隆抗体购于Abcam公司。

1.2 免疫组织化学方法

对已制作好的切片常规脱蜡水化, 3%过氧化氢甲醇溶液放置10 min, 微波热修复。加入用血清稀释液稀释的一抗(OV6为1∶40; Snail为1∶200), 4 ℃孵育16～22 h; 吸去抗体, 0.01 mol/L PBS缓冲液清洗3次, 5 min/次；加入PBS稀释的二抗，37 ℃孵育30 min; 加入显色液进行显色，用蒸馏水终止反应；梯度乙醇脱水，封片。

1.3 阳性判定标准

OV6蛋白阳性表达于细胞质, Snail蛋白阳性表达于细胞核，随机取5个高倍镜视野计数, OV6的评估以阳性染色面积及强度作为判定结果[4]。无色、淡黄色(<5%)为阴性染色；棕黄色(5%～30%), 棕褐色(>30%)为阳性染色。Snail的评估以阳性细胞核的面积作为判定结果[5]。0: 无染色; +: 1%～25%; 2+: 26%～50%; 3+: >50%, 3+定义为阳性染色。

1.4 统计学方法

对分类变量用卡方检验或Fisher确切概率法，使用Kaplan-Meier分析法计算总生存和无瘤生存率并绘制生存曲线，组间对比用log-rank法。采用spearman做相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义，所有统计学计算通过SPSS 18.0完成。

2 结 果

2.1 OV6和Snail在混合型肝癌组织中的表达情况

OV6蛋白阳性定位于胞浆，呈棕黄或棕褐色(图1)，阳性表达率为42.8%(30/70)。Snail蛋白阳性定位于细胞核(图2), 阳性表达率为47.1%(33/70)。

B. 阴性染色

A. 阳性染色

B. 阴性染色

2.2 OV6和Snail蛋白表达与临床病理学因素的关系及相关性分析

在混合型肝癌组织中, OV6和Snail蛋白表达与肿瘤数目、血AFP水平和微血管侵犯均相关(P<0.05); 而与乙肝表面抗原、肿瘤大小、肝硬化和TNM分期均无关(P>0.05), 见表1。OV6和Snail蛋白的表达呈正相关(r=0.270,P<0.05)，见表2。

表1 OV6和Snail蛋白表达与临床病理学因素的关系[n(%)]

表2 OV6和Snail蛋白在混合型肝癌组织中的相关性分析

2.3 OV6和Snail蛋白表达与预后的关系

利用Kaplan-Meier分析法, OV6和Snail蛋白表达影响患者术后总体生存率(P<0.05), OV6蛋白表达与术后无瘤生存率无相关性(P>0.05), 而Snail蛋白表达影响患者术后无瘤生存率(P<0.05)，见图3、4。

图3 OV6表达与预后的关系(A: P>0.05;B: P<0.05)

图4 Snail表达与预后的关系(A、B: P<0.05)

3 讨 论

混合型肝癌是一种罕见的肝脏恶性肿瘤，由于其发生率低，因此对其临床特点、诊断及治疗方面缺乏深刻认识。越来越多的研究[6-7]发现肝癌干细胞标志物，如OV6、Epcam、AFP等。卵圆细胞标记物OV6阳性的肝癌细胞具有更高的体内成瘤能力和化疗耐受性，从而有助于肿瘤的侵袭和转移。本研究也发现在混合型肝癌组织中OV6阳性表达的患者术后总体生存率低于表达阴性的。OV6蛋白表达与肿瘤数目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相关。与文献[4，8]报道基本一致。Wen Yang等[3]研究也发现，肝癌组织中OV6高表达影响患者总体生存和无瘤生存率。Snail基因超家族是一种含有锌指结构的转录抑制因子，包括Snail1、Snail2(Slug)和SIP1等，同时也是EMT的重要调节因子，其与E-cadherin启动子区E-box结合而抑制E-cadherin的转录，从而促进肿瘤的侵袭与转移[9-10]。近年来大量研究报道，Snail在促进肿瘤侵袭过程中获得肿瘤干细胞特性，从而促进许多恶性肿瘤的转移和复发。本研究也发现Snail阳性表达的患者术后总体生存率和无瘤生存率明显低于阴性表达，其在混合型肝癌组织中的表达与肿瘤数目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相关。这提示了Snail在混合型肝癌的发生及侵袭转移中可能起着重要的作用，与文献[5，11]报道基本一致。大量文献[12-14]报道肝癌干细胞的激活与EMT的转录因子之间存在相关性。Kim H等报道[11]在肝癌组织中通过免疫组化和mRNA水平检测发现包括Snail和Slug在内的诱导EMT的因子与K19的表达呈正相关，同时发现CD133表达与E-cadherin下调相关，并影响患者预后。这些结果进一步证实Snail家族作为诱导EMT的转录抑制因子可获得肿瘤干性特征，促进肿瘤侵袭和转移。目前关于OV6和Snail蛋白在肿瘤演变中的相互关系未见报道。本研究结果表明, OV6与Snail蛋白在混合型肝癌组织中的表达呈正相关(r=0.270，P<0.05)，且随着肿瘤数目、血AFP水平及微血管侵犯的增加，两者的表达率均升高。提示了OV6与Snail可能通过某些共同的途径在混合型肝癌的发生及侵袭中发挥协同作用，但其机制尚不清楚，有待研究。

综上所述，混合型肝癌是原发肝癌中少见的病理类型，临床表现不典型，影像学检查表现多变，术前诊断困难。联合检测OV6和Snail蛋白对混合型肝癌的诊断及预后判断有一定临床意义。

[1] Yin X, Zhang B H, Qiu SJ, et al.Combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma: clinical features, treatment modalities, and prognosis[J]. Annals of surgical oncology, 2012, 19(9): 2869.

[2] Koh K C, Lee H, Choi M S, et al. Clinicopathologic features and prognosis of combined hepatocellular cholangiocarcinoma[J]. American journal of surgery, 2005, 189(1): 120.

[3] Yang W, Yan H X, Chen L, et al. Wnt/beta-catenin signaling contributes to activation of normal and tumorigenic liver progenitor cells[J]. Cancer research, 2008, 68(11): 4287.

[4] Yang W, Wang C, Lin Y, et al. OV6(+) tumor-initiating cells contribute to tumor progression and invasion in human hepatocellular carcinoma[J]. Journal of hepatology, 2012, 57(3): 613.

[5] Yang M H, Chen C L, Chau G Y, et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2009, 50(5): 1464.

[6] Yamashita T, Ji J, Budhu A, et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features[J]. Gastroenterology, 2009, 136(3): 1012.

[7] Roskams T, De Vos R, Van Eyken P,et al. Hepatic OV6expression in human liver disease and rat experiments: evidence for hepatic progenitor cells in man[J]. Journal of hepatology, 1998, 29(3): 455.

[8] Lin C H, Liu C H, Tsai H L, et al. Expression of OV6in primary colorectal cancer and rectal cancer with preoperative chemoradiotherapy: a clinicopathological study[J]. Histopathology, 2013, 62(5): 742.

[9] Batlle E, Sancho E, Franci C, et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells[J]. Nature cell biology, 2000, 2(2): 84.

[10] Tsai C C, Chen Y J, Yew T L, et al. Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST[J]. Blood, 2011, 117(2): 459.

[11] Kim H, Choi G H, Na D C, et al. Human hepatocellular carcinomas with “Stemness”-related marker expression: keratin 19 expression and a poor prognosis[J]. Hepatology, 2011, 54(5): 1707.

[12] Seok J Y, Na D C, Woo H G, et al. A fibrous stromal component in hepatocellular carcinoma reveals a cholangiocarcinoma-like gene expression trait and epithelial-mesenchymal transition[J]. Hepatology, 2012, 55(6): 1776

[13] Dang H, Ding W, Emerson D, et al. Snail1 induces epithelial-to-mesenchymal transition and tumor initiating stem cell characteristics[J]. BMC cancer, 2011, 11:396.

[14] Naber H P, Drabsch Y, Snaar-Jagalska B E, et al. Snail and Slug, key regulators of TGF-beta-induced EMT, are sufficient for the induction of single-cell invasion[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2013, 435(1): 58.