高压氧治疗小鼠一氧化碳中毒所致迟发性脑病的疗效及其对病理机制的影响

冯树行, 王 静, 颜永红, 胡怀强, 曹秉振

(1. 第二军医大学济南军区总医院, 山东 济南, 250031; 2. 解放军第四六三医院, 辽宁 沈阳, 110046)

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康C57-6小鼠48只，体质量18～24 g, 平均20 g，由山东大学医学院实验动物中心提供。动物饲养于室温 (24±2) ℃的环境中，维持光、暗 12 h循环交替，并给予充足的食料和洁净饮水。将小鼠随机分为A、B、C组，A组为空气对照组8只，B组为CO中毒组20只, C组为CO中毒组20只。

1.2 建造模型

所有小鼠逐个测重、标记，40只小鼠建造CO中毒模型(济南市气体厂提供99.9%); A组给予空气(100 mL/kg)腹腔注射，连续7 d，作对照；B组给予 CO(100 mL/kg)腹腔注射，连续7 d; C组给予CO(100 mL/kg)腹腔注射，连续7 d, 并于CO中毒后0.5 h立即高压氧治疗, DS-II动物实验加压泵。纯氧大于86%，注意保暖，加压、减压各20 min, 治疗1 h, 连续7 d。

中毒症状: CO中毒约10 min出现症状，萎靡、少动, 0.5 h后，出现口唇、爪、尾巴颜色变红，呼吸急促、呼吸幅度明显增大，不活动，聚堆。有的出现轻度的兴奋和躁动；再加重表现四肢瘫软无力、行动迟缓；昏迷，大幅度呼吸，频率减慢，仰卧不动，随后死亡。高压氧组中毒0.5 h后，呼吸明显急促，幅度加大，通过高压氧治疗，症状明显减轻。

1.3 实验取材

中毒后每天反复观察4次以上，时间超过2 h，各组中再次出现活动减少、反应迟缓、刺激后躲避差，作为可疑脑病小鼠，尽量平均分配到每次取材中。1周后，B、C组确保1只出现症状的小鼠，各共取2只，A组2只，在严格的无菌操作下，氯胺酮(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯卧位，打开颅腔，取出脑组织，并分离出一侧大脑、小脑，以及切开脊椎骨，分离暴露出脊髓，剥出脊髓，去掉马尾与脊膜，同时取小鼠双侧坐骨神经，一同置于4%多聚甲醛以及 2%戊二醛中固定。分别在2周、3周、4周同样取材，最后进行检查。

1.4 组织病理染色

石蜡切片的制备: ① 固定。将脑组织、脊髓、坐骨神经分别固定于10%中性甲醛缓冲液中24～48 h; ② 脱水。将固定好的组织经自来水冲洗30 min后，依次放入75%乙醇4～5 h, 85%乙醇过夜, 90%乙醇2 h, 100%乙醇Ⅰ 1～2 h, 100%乙醇Ⅱ 1 h; ③ 透明。分别置于100%乙醇、二甲苯(1︰1)10 min, 二甲苯Ⅰ 20 min, 二甲苯Ⅱ20 min; ④ 浸蜡。分别置于石蜡Ⅰ(52～54 ℃)10 min, 石蜡Ⅱ(58～60 ℃)15 min, 石蜡Ⅲ(60～62 ℃)60 min; ⑤ 包埋。用熔点为60～62 ℃石蜡包埋，修块后4 ℃保存; ⑥ 切片、黏片：蜡块-20 ℃预冷20 min, 冠状位切片厚约4 μm, 30%乙醇充分展开腊片, 40～60 ℃温水中捞片、贴片, 58～60 ℃烤片2 h烘干熔蜡。

1.5 相关检查

1.5.1 主要仪器与设备：光学显微镜(日本产OLYMPUS-BX41TF型)，显微照相设备(日本产OLYMPUS PM-10AD型)，低温冰箱(日本产SANYO-MDF19型)，自动脱水机(日本产樱花TEKVIT型)，组织包埋机 (日本产樱花TEKTEC型)，石蜡切片机(德国LEICA)，微电脑恒温恒湿控制箱(德州市瑞科孵化设备厂)，DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)。

1.5.2 主要试剂：HE染色主要试剂为伊红Y-苏木素(国药集团上海化学试剂有限公司); KB染色主要试剂为Solent Blue 38( Alfa Aesar英国)碳酸锂(国药集团上海化学试剂有限公司)，Cresyl Violet acetate (焦油紫)(北京索莱宝科技有限公司)；Ed-1染色主要试剂为Ed-1antibody；GFAP染色试剂为GFAP antibody BA0056；MBP染色 试剂为MBP antibody，均来自博士德生物有限公司；免疫组织化学法主要试剂有免疫组化染色试剂盒、柠檬酸钠抗原修复液、PBS磷酸缓冲液、浓缩型DAB试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.6 统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计分析。两独立样本进行t检验，率比较采用χ2检验。显著性检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

1周内B组死亡9只，C组死亡5只; 2周后B组死亡3只，C组死亡1只; 2周后无死亡。A组无死亡。见表1。

表1 各组治疗效果比较[n(%)]

病理结果: HE染色:表现为染毒后1周海马神经元、小脑浦肯野细胞明显丢失，大脑皮层神经元可见到变性丢失，大脑皮层第5层的锥体细胞可见到萎缩嗜伊红深染。第2～4周皮层神经元仍见到变性坏死。高压氧组，表现相同变化，但程度减轻。第2周GFAP阳性细胞表达,高压氧组明显少于中毒组(见图1); ED-1阳性细胞从染毒第1周即出现，分布的皮层、大脑半球白质、小脑及脊髓等组织。第2周开始阳性细胞广泛见于大脑半球白质。但高压氧组阳性细胞数量明显少于单纯染毒组。脊髓的前外侧区可见到细胞变性丢失，高压氧治疗组情况要比单纯中毒组轻微。小脑颗粒细胞、桥核神经元及脊髓前角细胞仍保留良好。MBP标记髓鞘碱性蛋白，从第2周开始可见到大脑半球白质结果染色活性降低，高压氧组程度轻。 KB染色可见大脑及小脑白质结构疏松，存在的髓鞘脱失，但较之单纯中毒组，髓鞘损害程度较轻，且胶质细胞反应略轻微。

图1 染毒后第2周GFAP阳性细胞表达比较 (GFAP染色 200倍)

3 讨 论

一氧化碳中毒[1]是由于在相对密闭的室内燃烧取暖、烟囱不通、使用燃气加热器淋浴、城市中使用煤气生活、汽车尾气、个别自杀等引起。CO与血红蛋白的亲和力较氧和血红蛋白的亲和力要强240倍,但解离速度却比氧和血红蛋白的解离速度要慢3 600倍,使氧和血红蛋白的氧解离曲线左移,阻碍血红蛋白释放到组织,导致细胞缺氧。急性CO中毒轻者，脱离环境到通风地方，吸氧大多好转；重度中毒患者昏迷苏醒后，经过数日、数周或2～3个月的清醒期(假愈期)后,又出现神经精神症状[2], 称为一氧化碳中毒迟发性脑病(DEACMP)[3], 症状表现为精神异常，包括哭笑无常、行为怪异、人格改变等;智能下降，反应迟钝，言语减少，不会穿衣吃饭等;锥体外系症状帕金森症状；意识障碍以睁眼昏迷、木僵等为特征,严重者呈持续性植物状态；锥体系统症状，偏瘫、失语，以及尿便障碍植物神经症状等。个别出现周围神经损害症状。CO可直接影响心血管系统,中毒程度与吸入CO的浓度和持续时间密切相关[4]。DEACMP的损伤部位比较广泛, 因为中枢神经系统对缺氧非常敏感,故脑部最先受累,导致脑细胞水肿和/或细胞间质水肿,脑水肿又导致脑循环障碍,缺血性坏死,广泛的脱髓鞘病变,导致迟发性脑病，最常见的病理改变大脑皮层也可出现分层坏死,苍白球的缺血坏死, 脑白质中出现融合、不融合的脱髓鞘斑片; 基底节区、海马区及小脑有不同程度的病变, 海马锥体细胞变性坏死消失、小脑神经元缺损等; 脑血流出现异常如淤滞、血栓形成和出血等;这些改变可由CT或磁共振成像(MRI)证实[5-6]。

高压氧(HBO)能加速碳氧血红蛋白的解离,增强机体组织对一氧化碳的清除,恢复血红蛋白携氧能力,因此血氧分压越高,碳氧血红蛋白的解离以及一氧化碳的排除就越快;高压氧能明显提高血氧分压、增加血氧含量,提高血中溶解氧,快速纠正和改善组织中缺氧状态；增加ATP, 同时高压氧也能调节脑细胞酶的活性,尤其Na+-K+酶活性，减少细胞内Na+减轻脑水肿,减少Ca2+内流，减轻继发损害，提供了脑组织内需氧最佳环境,使脑神经元和胶质细胞在轴索和血管组织相对完好的基础上得以尽快地修复和再生[7-9]; 另外，高压氧有利于大脑神经细胞的结构和功能的恢复,因而对DEACMP和后遗症的防治具有很好的作用。有文献[10]报道,该病治疗总有效率为70.0%～79.5%, 其相关机制有: ① 通过提高血氧含量，增加组织氧供[11-13]，改善血管通透性，减少渗出和脑水肿; ② 使脑组织局部氧浓度提高、阻止脂质过氧化，阻止白细胞向脑微血管内皮细胞的黏附，促进失活的细胞色素氧化酶再生; ③提高血管成纤维细胞的分裂、增生，及胶原纤维的形成，促进侧支循环建立; ④ 降低血黏，减少无氧酵解、血小板聚集等。本研究采用高压氧治疗组小鼠的大脑皮层、基底节区、海马区、小脑等部位损伤较其他组轻，小胶质细胞、胶质细胞增生减低，表明高压氧既能减轻直接损伤，还能减轻了继发损伤，对DEACMP有很好的改善作用。临床上常使用疏血通、丹参或川芎嗪注射液治疗，其能改善脑循环、降低血液黏度、营养神经细胞治疗[14-15]。在中毒早期同时给予脑活素、奥拉西坦、胞二磷胆碱、三磷酸腺苷、烟酸、维生素C、维生素E等营养神经细胞及改善脑代谢药物，以解除脑水肿和降低颅内压。脑水肿常在急性一氧化碳中毒后2 d达高峰，故及早应用高渗脱水剂、大剂量糖皮质激素、利尿剂等可促进脑血液循环，维持呼吸循环功能，有助于防治脑水肿[16]。自由基清除剂、钙通道拮抗剂、钙超载及自由基所引发的脂质过氧化作用均参与了脑组织损伤的过程。因此，在急性中毒早期给予维生素C、维生素E、超氧化物歧化酶等抗氧化剂及自由基清除剂依达拉奉治疗有助于防治DEACMP。钙通道拮抗剂尼莫地平对缺血性脑损伤有良好的保护作用，有研究[17-18]发现尼莫地平能显著降低一氧化碳中毒小鼠急性期病死率和总病死率，并改善中毒所致的学习记忆能力的损伤，避免海马神经元延迟性死亡，阻遏单胺氧化酶活性的异常升高。

DEACMP的病程较长，常伴有精神和锥体外系症状，积极合理的临床治疗有助于缩短病程，改善预后[19-22]。对频繁抽搐、极度烦躁不安者对症，给予安定等抗惊剂; 肌张力增高者使用安坦、美多巴等。积极治疗并发症，防治感染，充分休息，避免各种精神刺激和意外事件的发生[23-25]。

[1] 岳颖, 金军, 刘建卫, 等. 急性一氧化碳中毒急救的研究进展[J]. 中国中医急症, 2012, 21(4): 60.

[2] 胡浩. 依达拉奉联合高压氧治疗急性一氧化碳中毒迟发性脑病30例分析[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2010, 13(1): 67.

[3] 易露. 高压氧治疗急性一氧化碳中毒迟发性脑病的临床疗效观察[J]. 医学理论与实践, 2014, 27(2): 187.

[4] 王承辉. 甘露醇对一氧化碳中毒患者近期症状的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2009, 23(1): 71.

[5] 何家礼. 高压氧联合药物治疗重度急性一氧化碳中毒临床观察[J]. 临床荟萃, 2010, 25(24): 2169.

[6] 许罗俊, 周树荣, 唐音, 等. 高压氧对重度一氧化碳中毒休克的促醒作用[J]. 中国临床康复, 2003, 9(5): 3535.

[7] 叶任高, 陆再英. 内科学[M]. 6版. 北京: 人民卫生出版社, 2004: 973.

[8] 张建宏,刘金平,常勇霞,等.高压氧治疗一氧化碳中毒迟发性脑病的疗效观察[J].中国实用神经疾病杂志, 2006, 9(6): 150.

[9] 张树新. 高压氧治疗对一氧化碳中毒迟发性脑病患者的影响[J]. 中华航海医学与高气压医学杂志, 2011, 18(4): 239.

[10] 杨廷芳, 任主军, 郝强, 等. 一氧化碳中毒后迟发性脑病的病程及预后[J]. 卒中与神经疾病, 2007, 14: 220.

[11] 甄君, 王雪晴, 耿建红, 等. 高压氧联合运动疗法对脑梗死功能恢复的影响[J]. 中华全科医学, 2011, 9(9): 1348.

[12] 潘锐, 唐亚梅, 容小明等. 一氧化碳中毒迟发性脑病临床特征及危险因素分析[J]. 中国实用内科杂志, 2012, 32(10): 787.

[13] 龙霄翱, 梁远生, 陈兵, 等. 微创血肿清除术后高压氧联合依达拉奉治疗高血压脑出血疗效观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(7): 1022.

[14] 肖端, 吕田明, 陆兵勋, 等. 半结扎脑表面动脉构建大鼠局灶性淋巴滞留性脑病动物模型[J]. 南方医科大学学报, 2011, 31(1): 125.

[15] 朱瑞昉. 高压氧联合药物治疗急性脑梗死疗效观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(9): 1394.

[16] 尹素梅. 气管切开患者行高压氧治疗时的陪舱护理体会[J]. 中华全科医学, 2011, 9(2): 323.

[17] 杨俊卿, 周歧新. 尼莫地平对一氧化碳中毒致小鼠脑损伤保护作用研究[J]. 工业卫生与职业病, 2001, 27(1): 19.

[18] 戴瑛, 吴祖舜. 脑出血大鼠局部血流量的改变及尼莫地平的干预作用[J]. 临床神经病学杂志, 2008, 21(1): 49.

[19] 甄君, 王雪晴, 耿建红, 等. 高压氧联合运动疗法对脑梗死功能恢复的影响[J]. 中华全科医学, 2011, 9(9): 1348.

[20] 尹素梅. 气管切开患者行高压氧治疗时的陪舱护理体会[J]. 中华全科医学, 2011, 9(2): 323.

[21] 龙霄翱, 梁远生, 陈兵, 等. 微创血肿清除术后高压氧联合依达拉奉治疗高血压脑出血疗效观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(7): 1022.

[22] 潘锐, 唐亚梅, 容小明, 等. 一氧化碳中毒迟发性脑病临床特征及危险因素分析[J]. 中国实用内科杂志, 2012, 32(10): 787.

[23] 龙霄翱, 梁远生, 陈兵, 等. 微创血肿清除术后高压氧联合依达拉奉治疗高血压脑出血疗效观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(7): 1022.

[24] 朱瑞昉. 高压氧联合药物治疗急性脑梗死疗效观察[J]. 中华全科医学, 2011, 9(9): 1394.

[25] 肖端, 吕田明, 陆兵勋, 等. 半结扎脑表面动脉构建大鼠局灶性淋巴滞留性脑病动物模型[J]. 南方医科大学学报, 2011, 31 (1): 125.