高效液相法测定虾青素的含量*

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(1.中药固体制剂国家工程研究中心 江西 南昌 330006；2.江西中医药大学 江西 南昌 330006)

虾青素(Astaxanthin,3，3'-二羟基4,4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素)是一种类胡萝卜素衍生物，呈鲜红色，具有很强的抑制肿瘤发生和生长，抗氧化，抵御紫外线，增强人体免疫功能，改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育等作用，特别是抗氧化作用超强，被誉为“超级抗氧化剂”[1-3]，因此在化妆品、保健品和医药中具有广泛的应用前景。目前，虾青素的检测方法有薄层色谱法、分光光度法[4]、高效液相色谱法[5-7]。传统的分光光度法只能测定总虾青素类酯的含量。采用皂化的方法可将不同的虾青素类酯完全皂化成游离虾青素，并采用高效液相色谱法可以解决这个问题。本文采用高效液相色谱法，建立了皂化后游离虾青素含量测定的方法，考察了不同皂化时间、皂化溶剂和皂化时碱浓度对游离虾青素的影响，并测定了不同虾青素提取物中游离虾青素的含量。

1 仪器与材料

Waters高效液相色谱仪(Waters 2695分离单元，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站)；Millipore-Q纯水器(美国Millipore公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；超声波清洗仪：KQ3200(昆山市超声仪器有限公司)。虾青素对照品(Dr. Ehrenstorfer Gmbh，批号：CA10307000纯度：97.1%)、粉状虾青素提取物1(Cyanotech公司)、粉状虾青素提取物2(饲料级)、油状虾青素提取物(Cyanotech公司)、普丽普莱红球藻提取物(虾青素)软胶囊(PURITAN'S PRIDE,INC.Holbrook,NY 11741 U.S.A.)、金奥力虾青素压片糖果(威海紫光生物科技开发有限公司)，甲醇为色谱纯，氯仿、无水乙醇、二氯甲烷、氢氧化钾为分析纯，水为超纯水，BHT。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：色谱柱为Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(95∶5)；流速：1mL/min；检测波长：475nm；检测器：紫外检测器；进样量：10μL；柱温：室温。

2.2 测定方法

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取虾青素对照品4.01mg，置50mL量瓶中，用少量二氯甲烷(1mL)振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。精密移取此储备液2mL置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取8mg样品，精密称定，加5mL溶剂(二氯甲烷：甲醇=1∶3)，再加入3mL体积的1%KOH甲醇溶液，超声15min，用溶剂定容至10mL。置黑暗环境下，4℃冰箱中皂化7 h左右，皂化后的虾青素提取液过0.45μm膜作为供试品溶液。

分别取上述供试品溶液和对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，测定峰面积。按外标法以峰面积计算虾青素的含量，色谱图见图1、图2。

图1 虾青素对照品溶液

图2 粉状虾青素提取物1(Cyanotech公司)

2.3 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下对照品溶液，进样5，10，15，20，25，30μL，以峰面积(Y)对对照品量(X)进行线性回归处理，线性方程为：Y=53774X-7242.3，r=0.9993，结果表明在0.0802～0.4812/μg内进样体积与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度 精密吸取2.2.1项下对照品溶液10μL，连续进样6次，测定虾青素的峰面积，峰面积的RSD分别为0.93%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取虾青素提取液，照2.2.2项下的方法制备供试品5份，照2.1项下色谱条件测定峰面积，计算含量，结果平均含量为107.6μg/mL，RSD为1.09%。

2.6 回收率试验 取虾青素供试品溶液5份，分别加入2.2.1项下对照品溶液4mL，按2.1项下色谱条件进行检测，记录峰面积，并计算回收率，结果见表1。

表1 回收率测定结果(n=5)

2.7 不同虾青素提取物的含量测定 实验比较了本文建立的方法和紫外分光光度法[8]两者的分析结果，结果如表2。结果表明，紫外分光光度法并不能准确的检测物质中游离虾青素的质量浓度，游离虾青素的最大吸收波长在476nm附近，虾青素酯在476nm波长处也存在吸收，其所测是游离虾青素与虾青素类酯的总和[7]。而本文建立的方法，皂化后虾青素类酯能很好的转化为游离虾青素，能通过高效液相法较为准确的测出其游离虾青素的含量。

表2 不同虾青素产品中虾青素测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 经波长扫描，虾青素在本流动相中的最大吸收波长为475nm，故选择475为检测波长。

3.2 皂化条件考察

3.2.1 皂化溶剂的影响 考察了甲醇、二氯甲烷、丙酮、二氯甲烷-甲醇(1∶3)、丙酮-甲醇(3∶1)作为皂化溶剂对虾青素类酯皂化效率的影响。结果表明，使用不同皂化溶剂皂化后虾青素的含量分别为：甲醇为0.56%，二氯甲烷为0.71%，丙酮为0.48%，二氯甲烷-甲醇为1.32%，丙酮-甲醇为0.89%。因此确定皂化溶剂为二氯甲烷-甲醇(1∶3)。

3.2.2 碱浓度的影响 不同浓度的KOH甲醇溶液影响虾青素的皂化效率。当浓度低时皂化不完全，浓度过高又会导致虾青素氧化，并破坏虾青素而使得皂化效率降低。本文考察了0.1%、0.5%、1%、2%和3%不同浓度的KOH甲醇溶液的皂化效率。结果表明，当KOH甲醇溶液的浓度为1%时，能取得较好的皂化效率。其虾青素的含量分别为：0.1%KOH甲醇为0.44%，0.5%KOH甲醇为1.26%，1%KOH甲醇为1.36%，2%KOH甲醇为0.46%，3%KOH甲醇为0.076%。因此确定KOH甲醇的浓度为1%。

3.2.3 皂化时间的影响 在确定了上述皂化条件后，对不同的皂化时间进行考察，分别考察了皂化1，3，5，7，9，11，13h和15h，结果表明，皂化时间为7h时，虾青素的含量最大。其虾青素的含量分别为：1h为0.52%，3h为0.91%，5h为1.10%，7h为1.36%，9h为1.35%，11h为1.32%，13h为1.11%，15h为1.05%。因此确定皂化时间为7h。

4 结论

本文建立了KOH皂化不同虾青素提取物中虾青素类脂，高效液相色谱紫外检测游离虾青素含量的方法，该方法操作简便、快速、准确、稳定可靠，可用于虾青素的含量测定；优化了皂化条件，使得皂化更加方便、简单、快捷；分析比较了紫外分光光度法和高效液相法测定不同虾青素提取物中虾青素的含量，结果表明，紫外分光光度法不能准确测定游离虾青素的含量。

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