HPLC测定银黄颗粒中绿原酸含量及不确定度分析*

★ 韦国兵 胡奇军 张秀秀

(江西中医药大学 江西 南昌 330004)

银黄颗粒是由金银花和黄芩两味中药提取精致而成,金银花其活性成分主要为绿原酸、异绿原酸，因此银黄颗粒具有清热疏风，利咽解毒的功效：可用于外感风热、肺胃热盛所敛的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热；急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等的预防和治疗。中国药典通过测量其主要成分绿原酸和黄芩苷的含量，对银黄颗粒的质量进行检测[1]。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性与测量结果相关联系的参数[2]，是被测量客观值在某一量值范围内的一个评定，其大小决定了测量结果的实用价值。不确定度越小，测量结果的质量越高，使用价值越大。本文对银黄颗粒中绿原酸的含量进行测量，并对不确定度进行分析，以找出影响不确定度的因素，对不确定度进行评估，为药物含量测定提供科学依据，并初步建立HPLC测定法的不确定度评定方式。

1 仪器与试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪;Kromasil100-5 C18ODS2(250mm×4.6mm，5μm)型色谱柱;AB104-N(METTER)电子天平;KQ-100型超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所(纯度>99%,批号：110753-201314)，银黄颗粒(张家界康尔佳制药有限公司，批号20131206、20131207、20131208)，甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 银黄颗粒中绿原酸的HPLC法含量测定

2.1.1 色谱条件系统适用性试验 色谱柱：Kromasil100-5 C18ODS2(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇∶水∶磷酸=48∶52∶0.3，流速：1.0mL/min，检测波长：324nm，进样量：20μL，柱温：25℃。理论塔板数以黄芩苷峰面积计算应不得少于2500。

2.1.2 对照品的配制 取绿原酸对照品约2.0mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加入超纯水使其溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀即得绿原酸对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取本品约0.1000g，置于100mL容量瓶中，加超纯水50mL，超声处理30min，取出，放冷，加超纯水定容至刻度，摇匀。经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 测定方法

图1 绿原酸对照品的色谱图

图2 银黄颗粒的色谱图

2.1.5 线性关系考察 精密吸取浓度分别为：0.00125，0.025，0.005，0.02，0.04mg/mL的对照品溶液20μL，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样量(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程Y=4.4215×104X+6.4611(r=0.9999)，结果表明绿原酸在0.025～0.8μg线性关系良好。

2.1.6 样品的含量测定 分别精密吸取对照品溶液、与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，按外标法(峰面积)计算，结果银黄颗粒中绿原酸的含量为5.27mg/g,即为0.527%(n=3)。

表1 含量测定 /mg·g-1

2.1.7 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液20μL，连续进样5次，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得绿原酸峰面积的RSD为0.59%。

2.1.8 稳定性试验 将批号为20131206的样品按“2.1.3”项方法制得供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h进样20μL，按上述的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得峰面积的RSD为0.65%，结果表明供试品溶液至少在24h内稳定。

2.1.8 重复性实验 对3个批次(批号20131206、20131207、20131208)，样品分别进行重现性试验，每批次按上述供试品溶液的制备方法制备6份样品，按上述色谱条件进行测定，结果3个批次的绿原酸质量分数的RSD平均值分别为0.62%、0.98%、1.21%。

2.1.9 加样回收实验 分别取三份批号为20131206的银黄颗粒供试品5mL于10mL容量瓶中，再用0.04mg/mL的标准品配制80%、100%、120%的溶液，按上述色谱条件进行色谱分析和测定，计算加样回收率，平均回收率为98.9%，RSD为2.7%。

表2 加样回收率实验数据表

2.2 数学模型 根据实验过程，建立含量测定数学模型，其中Ci为对照品的浓度，As为样品的峰面积，Vs为样品的体积，Ai为对照品的峰面积，ms为样品的称样量。

2.3 不确定对分析 根据数学模型分析，单份供试品含量测定的不确定度主要来源于Vs，ms，Ai，As，Ci5个分量[4,5]，但是在实验过程中mi也可以间接的通过影响Ai来影响实验结果，因此本实验认为有六个因素主要影响不确定度。经过对实验整个过程的不确定因素分析，并对上述6个因素进行归纳，其不确定度可以归纳为4个方面：对照品峰面积的不确定度、对照品溶液浓度的不确定度、样品峰面积的不确定度、样品溶液浓度的不确定度[6]。每一个不确定度分量中又应考虑每一个影响因素，直至影响因素变得足够小，对结果的影响可以忽略时为止。图1列出了本实验的所有不确定度分量的因果关系图，有利于更直观地分析所有的不确定度来源[7]。

图3 不确定度分量的因果关系图

3 不确定度分量的量化

3.2 质量类不确定度u(mi，ms)

3.3 体积类不确定度(Vi,Vs)

3.4 峰面积类不确定度(Ai，As)

4 不确定度的合成与评定

4.1 不确定度分量汇总表 将所有的不确定度分量进行汇总(表2)，有利于更加直观地分析各分量的大小。

4.3 扩展不确定度及报告不确定度 取95%的置信概率，取包含因子k=2，则绿原酸的扩展不确定度Ur(S)=0.527%×0.14758×2=0.1556%。本次实验含量测定结果可表示为(5.27±0.1556)mg/g。

表3 不确定度分量汇总表

5 讨论

在测量过程中，由于对照品和样品都是一次性配置、定容好的，因此在实验中忽略了对照品和样品配制过程中定容体积的重复性所引起的不确定度。由于HPLC仪本身对测定结果影响因素很多，难以对其进行一一评估。在实际测定中，HPLC仪误差引起的不确定度体现在色谱峰面积的测量结果中，所以对HPLC仪的进样精密度、体积流量和流量精密度等各因素的不确定度分量不作细化讨论。同时对照品溶液的配制中采用超纯水为溶剂，其膨胀系数相对来说比较小一点，故在试验过程中由温度引起的的偏差也比较小，溶液定容引入的不确定度也较小。本实验不确定度评估中，从表2各标准分量的不确定可以看出，本方法测量银黄颗粒中绿原酸结果的各分量不确定度均较小，测量结果的不确定度主要来自电子天平称量示值的不准确度，对照品和样品溶液进样重复性的不确定度，同时还包括供试品溶液制备的重复性不确定度等方面。在分析了上述影响测量不确定度的原因后，应该采取相应措施，测量结果的不确定度可以得到进一步减小。本文所建立的方法考虑了HPLC测定过程中产生不确定度的大部分因素，为同类实验提供了有益的参考。

[1]郭新社,袁琦,于海林.快速测定银黄口服液的含量[J].中成药,2009,31(12):1 955-1 957.

[2]饶毅,夏川川,周海滨，等.高效液相色谱法测定白芍总苷的不确定度分析[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(19):89-93.

[3]ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of calibration and testing laboratories[S].Geneve,2005:9．

[4]魏惠珍,谢菲，饶毅，等.HPLC法测定元胡止痛胶囊中延胡索乙素及其不确定度评定[J].中草药,2012,43(2):299-302.

[5]饶毅,刘玲,刘琼，等.离子色谱法测定大黄药材中二氧化硫残留量的不确定度评价[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(22):32-36.

[6]魏惠珍,饶毅,李新南，等.气相色谱内标法测定牡荆油胶丸中β-丁香烯含量的不确定度评定[J].药物分析杂志,2009,29(11):1 881-1 885.

[7]魏惠珍,李新南,龚建平，等.紫外分光光度法测定罗银胶囊中总黄酮含量的不确定度评定[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(4):39-43.