水通道蛋白-8对结肠癌细胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影响

李建强 张宏蕊 石晓明 吕柏楠

·论著·

水通道蛋白-8对结肠癌细胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影响

李建强 张宏蕊 石晓明 吕柏楠

目的通过表达水通道蛋白-8(AQP-8)真核表达载体，观察水通道蛋白AQP-8对HT-29细胞凋亡及凋亡抑制蛋白(IAPs)表达的影响。方法取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞株用于实验。构建AQP-8真核表达载体并转染HT-29细胞，通过Western blot检测GFP-AQP-8转染效率；采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率；流式细胞术检测细胞凋亡率；通过Real Time-PCR和Western blot检测转染GFP-AQP-8的HT-29细胞凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin和Livin表达水平。结果Western blot结果显示，GFP-AQP-8转染后结肠癌HT-29细胞AQP-8基因表达显著上调(P<0.05)。MTT分析结果显示，转染了GFP-AQP-8的结肠癌HT-29细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)；流式细胞分析发现，转染了GFP-AQP-8的HT-29细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。Real Time-PCR和Western blot结果显示，与转染GFP-N1的阴性对照组相比较，转染了GFP-AQP-8的HT-29细胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)，NIAP表达变化不明显(P<0.05)。结论过表达AQP-8可抑制HT-29细胞生长，并能通过下调c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表达诱导HT-29细胞凋亡。

水通道蛋白-8；结肠肿瘤；凋亡；凋亡抑制蛋白

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，世界范围内恶性肿瘤死因中，其病死率居第二位[1]。结肠癌易发生浸润和转移的特点往往导致治疗效果不佳。而在肿瘤浸润和转移过程中的代谢与营养交换离不开水分子的参与。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一类广泛存在于细胞膜上的、具有高选择性的、特异转运水分子的通道[2]。研究显示，水通道蛋白在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用[3]，其中包括对肿瘤细胞凋亡的影响[4]。细胞凋亡抑制蛋白(inhibitaors of apoptosis proteins,IAPs)是一类重要的凋亡抑制因子，参与了多种细胞的凋亡调控。本文通过体外过表达AQP-8，观察其对结肠癌细胞凋亡及IAPs家族成员表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 结肠中分化腺癌细胞株HT-29，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MTT，美国Sigma公司；DMEM/F12培养液、胰蛋白酶，Gibco公司；荧光定量RT-PCR试剂盒，美国Promega公司；ABI 7500 PCR仪，美国ABI公司；AQP-5、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH抗体，美国Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；FASCalibur流式细胞仪，BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：人HT-29细胞于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养，于37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中孵育。用0.25%胰蛋白酶溶液消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 GFP-AQP-8转染和实验分组：用软件设计AQP-8基因特异性引物，提取HT-29细胞总RNA，采用RT-PCR法扩增AQP-8基因，与质粒载体GFP-N1进行酶切、链接，经过转化、筛选、鉴定并测序。转染前24 h于6孔板中接种HT-29细胞，密度为4×106个/ml。转染前用无血清无抗生素的DMEM/F12清洗细胞，经脂质体介导法，按照试剂说明书用转染试剂LipofectamineTM 2000将GFP-AQP-8或对照质粒GFP-N1转染HT-29细胞。转染24 h后，检测转染效率及PCNA和P53表达。实验分组为：正常对照组、GFP-N1空载体组和GFP-AQP-8组。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖率：对数生长期的HT-29细胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化并接种于96孔板，接种密度为5×104个/ml，每组设6个复孔。各组细胞于实验结束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h后，弃去培养液，每孔加入DMSO 150 μl，室温振荡15 min至结晶完全溶解，用酶标仪于波长490 nm测吸光度OD值。以上实验重复3次。增殖抑制率(%)=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，4℃，500 g离心，去上清，沉淀中加入1 ml预冷的70%乙醇，轻轻吹打，4℃固定过夜。4℃，500 g，离心10 min，去上清，用1×PBS清洗2次。加入1 ml PI染液将细胞重悬，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。以上实验重复3次。

1.2.5 RNA提取及Real Time-PCR：收集细胞，按照Invitrogen公司Trizol试剂的产品说明书要求，采用一步法提取RNA。测定RNA纯度和浓度，并经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性后，各组都取1 μg RNA，按试剂盒说明书要求进行反转录反应及荧光实时定量PCR反应。PCR反应参数为：95℃ 5 min预变性后，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行40个循环，于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。扩增结束后，以GAPDH为内参照基因，计算目的基因表达的相对定量值(RQ值)及以此为依据进行统计学分析。所用引物序列为如下：c-IAP1上游引物：5’-GAAGACATCTCTTCATCGAGG-3’，下游引物：5’-CCACAGGTGTATTCATCATGAC-3’c-IAP2上游引物：5’-TCCTAGCTGCAGATTCGTTC -3’，下游引物：5’-GGTAACTGGCTTGAACTTGAC-3’。XIAP上游引物：5’-GCACGAGCAGGGTTTCTTTATACTGGTG-3’，下游引物：5’-CTTCTTCACAATACATGGCAGGGTTCCTC-3’。NIAP上游引物：5’-CTGGGCCTAGATGCAGTTCAG -3’，下游引物：5’-ACGGCTCATAAGTCACAAAAGTC-3’。Survivin上游引物：5’-CTTTCTCAAGGACCACCGCA-3’，下游引物5’-GCCTCGGCCATCCGCT-3’。Livin上游引物：5’-AGTTCCTGCTCCGGTCAAAA-3’，下游引物5’-GCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3’。GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。

1.2.6 Western blot法检测目的蛋白质表达：收集细胞，用预冷的1×PBS洗涤3次，于细胞裂解液中重悬细胞，冰上裂解间断涡旋30 min后，4℃，8 000 r/min离心10 min，上清即为细胞总蛋白。用改良的Lowry法定量后，各组取等量的蛋白依次经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、电转移至PVDF膜、5%脱脂奶粉室温封闭后，分别用稀释后的AQP-8、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH一抗4℃孵育过夜，TTBS于室温摇床振摇漂洗三次后加入相应二抗，室温孵育2 h，化学发光法进行显色，对条带进行吸光度积分扫描。用各蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

2 结果

2.1 AQP-8真核表达载体转染效率的鉴定 Western-blot结果显示，转染了GFP-N1空载体组的对照细胞中AQP-8表达非常低，而转染了GFP-AQP-8的HT-29细胞AQP-8的表达显著上调，表明GFP-AQP-8质粒转染HT-29细胞后能高效表达AQP-8，而转染GFP-N1空载体的阴性对照组与正常对照组的细胞相比，AQP-8的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

A

B

2.2 转染GFP-AQP-8对HT-29细胞增殖的影响 MTT检测转染GFP-AQP-8对细胞增殖活力的影响，结果显示，与转染和GFP-N1的阴性对照组相比，转染了GFP-AQP-8的HT-29细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)，提示上调AQP-8的表达可抑制HT-29细胞增殖。转染GFP-N1空载体的阴性对照组与正常对照组的细胞相比，增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 转染GFP-AQP-8对HT-29细胞凋亡的影响 流式细胞术检测转染GFP-AQP-8对HT-29细胞凋亡的影响，结果显示，与转染和GFP-N1的HT-29的阴性对照组相比，转染了GFP-AQP-8的HT-29的细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，提示上调AQP-8的表达可促进HT-29细胞凋亡。转染GFP-N1空载体的阴性对照组与正常对照组的细胞相比，细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 HT-29细胞增殖抑制率和细胞凋亡率无变化 ±s

注：与GFP-N1组比较，*P<0.05

2.4 转染GFP-AQP-8对HT-29细胞IAPs家族成员表达的影响 Real Time-PCR和Western blot分别检测HT-29细胞IAPs家族成员c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA和蛋白表达，结果显示，与转染GFP-N1的阴性对照组相比，转染了GFP-AQP-8的HT-29细胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)，NIAP表达变化不明显(P>0.05)，转染GFP-N1空载体的阴性对照组与正常对照组相比，各因子表达差异无统计学意义(P>0.05)。图2～4。

图2 3组c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA 表达的变化

图3 3组c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表达的变化

图4 3组c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表达的变化(Western blot)

3 讨论

细胞凋亡是细胞内正常的生理过程，可以消除机体内有害细胞，防止细胞的过度增殖。可见，凋亡是机体维持正常细胞功能的关键。而肿瘤的发生机制之一是细胞凋亡异常导致细胞的过度增生。近年来，一组广泛存在于多种细胞内、具有抑制凋亡作用，被称为凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的一类内源性凋亡抑制蛋白逐渐被关注。该家族成员具有结构同源性，与肿瘤、神经细胞凋亡有关，在人体内的过度表达可导致细胞凋亡不足最终形成肿瘤。以IAPs为靶点的治疗可为临床肿瘤治疗提供新思路。

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是特异的转运水分子的蛋白家族，主要功能是调节水进出细胞。在肿瘤细胞的高代谢过程中，水通道蛋白发挥这重要的作用。已有研究表明，AQPs表达与细胞凋亡密切相关，通过直接或间接改变AQPs表达可影响凋亡过程[5,6]。

然而，AQPs家族成员的表达模式不尽相同，比如在结肠癌组织中， AQP-5表达上调，AQP-8表达下调[7]。此外，AQP-8在结肠癌组织中低表达，在星形细胞瘤组织中AQP-8则高表达[8]。AQP-8在结肠癌组织中表达下调，且与淋巴结转移及TNM分期相关[9]，提示AQP-8在人结肠癌的发生、发展及转移的过程中可能发挥重要作用。目前，AQP-8 在结肠癌中表达下调的机制研究相对较少。本研究通过体外过表达的方式，首次研究AQP-8对HT-29细胞凋亡及IAPs表达的影响。

本研究发现，过表达AQP-8可抑制HT-29细胞生长，促进其凋亡。细胞是否凋亡取决于促凋亡和抑凋亡蛋白之间的平衡，促凋亡蛋白表达增高和/或抑凋亡蛋白表达降低均可促进细胞凋亡。IAPs 蛋白通过与执行凋亡的酶类Caspase3/7/9结合，抑制其催化活性，阻断细胞凋亡进程。本文明确了过表达AQP-8表达能促进凋亡后，接着对IAPs家族蛋白的表达进行检测。c-IAP1和c-IAP2可直接抑制Caspase的活性[10]。XIAP的作用广泛、稳定、高效，被认为最有效的Caspase抑制剂[11]。NIAP结构和功能与其他成员差别较大，大多关于NIAP的研究集中于神经系统。不过，已有研究显示，乳腺癌中NIAP高度表达，且与预后相关[12]。Livin高表达于多种肿瘤，可通过抑制Caspase和激活TAK1/JNK1通路抑制细胞凋亡[13]。Survivin也是作用较强的凋亡抑制蛋白，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。我们的结果表明，过表达AQP-8不同程度下调了c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的表达，但不影响NIAP表达，表明HT-29细胞中还存在其他分子调控IAPs家族成员的表达。

综上所述，过表达AQP-8可能通过下调c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表达诱导HT-29细胞凋亡，本研究为AQPs对结肠癌的作用研究及靶向性治疗提供了新的依据。

1 László L.Predictive and Prognostric Factors in the complex treatment of patients with colorectal cancer.Magy Onkol,2010,54:383-394.

2 Maqni F,Sarto C,Ticozzi D,et al.Proteomic knowledge of humanaquaporins.Proteomics,2006,6:5637-5649.

3 Nico B,Ribatti D.Aquaporins in tumor growth and angiogenesis.Cancer Lett,2010,294:135-138.

4 Jablonski EM,Mattocks MA,Sokolov E,et al.Decreased aquaporin expression leads to increased resistance to apoptosis in hepatocellular carcinoma.Cancer Lett,2007,250:36-46.

5 Bell CE,Larivière NM,Watson PH,et al.Mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathways mediate embryonic responses to culture medium osmolarity by regulating Aquaporin 3 and 9 expression and localization,as well as embryonic apoptosis.Hum Reprod,2009,24:1373-1386.

6 Lakner AM,Walling TL,McKillop IH,et al.Altered aquaporin expression and role in apoptosis during hepatic stellate cell activation.Liver Int,2011,31:42-51.

7 Wang W,Li Q,Yang T,et al.Expression of AQP5 and AQP8 in human colorectal carcinoma and their clinical significance.World J Surg Oncol,2012,10: 242.

8 朱淑娟,孙善全,许士叶,等.水通道蛋白4和8 在人不同病理级别星形细胞瘤组织中的表达.中国病理生理杂志,2012,28:796-801.

9 Fischer H,Stenling R,Rubio C,et al.Differential expression of aquaporin 8 in human colonic epithelial cells and colorectal tumors.BMC Physiol,2001,1: 1.

10 Sarela AI,Macadam RC,Farmery SM,et al.Expresssion of the antiapoptosis gene surviving predicts death from recurrent colorectal carci noma.Gut,2000,46: 645-650.

11 Eckelman BP,Drag M,Snipas SJ,et al.The mechanism of peptide-binding specificity of IAP BIR domains.Cell Death Differ,2008,15:920-928.

12 Maier JK,Balabanian S,Coffill CR,et al.Distribution of neuronal apoptosis inhibitory protein in human tissues.J Histochem Cytochem,2007,55:911-923.

13 Crnkovic-Mertens I,Hoppe-Seyler F,Butz K.Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the livin/ML-IAP/KIAP gene.Oncogene,2003,22:8330-8336.

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本刊编辑部

EffectofAQP-8oncellapoptosisandexpressionofIAPsinhumancoloncancerHT-29cellsinvitro

LIJianqiang*,ZHANGHongrui*,SHIXiaoming,etal.

*DepartmentofSurgery,XinleSocialInsuranceWorkers’Hospital,Hebei,Xinle050700,China

ObjectiveTo investigate the effects of aquaporin-8 (AQP-8) on cell apoptosis and expression of inhibitors of apoptosis proteins(IAPs) by means of eukaryotic expression vector that expresses AQP-8 in human colon cancer HT-29 cells in vitro.MethodsHuman colon cancer HT-29 cells at logarithm growth period were used in the experiment.AQP-8 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into HT-29 cells.Western Blot was used to detect the transfection efficiency;MTT assay was used to detect the cell growth inhibition rate;flow cytometry(FCM) was used to measure the cell apoptosis rate.The expression levels of mRNA and protein of IAPs including c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP,Survivin and Livin were detected by fluorescence quantitative Real-time RT-PCR and Western Blot.ResultsThe results by Western Blot showed that the expression levels of AQP-8 were significantly up-regulated in colon cancer HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection (P<0.05).MTT analysis showed that the proliferation inhibition rate was increased significantly in HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection,as compared with that in GFP-N1 control group (P<0.05).FCM analysis showed that GFP-AQP-8 transfection obviously induced HT-29 cell apoptosis (P<0.05).The results of fluorescence Real-time quantitative RT-PCR and Western Blot showed that the expression levels of mRNA and protein of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin,and survivin in HT-29 cells were significantly decreased by AQP-8 overexpression (P<0.05).However,the expression levels of NIAP mRNA and protein had no obvious change (P>0.05).ConclusionThe overexpression of AQP-8 can inhibit growth of HT-29 cell and can induce HT-29 cell apoptosis by down-regulating the expression levels of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin and survivin.

aquaporin-8;colonic neoplasms;apoptosis;inhibitor of apoptosis proteins

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.22.005

050700 河北省新乐市社会保险职工医院外科(李建强、张宏蕊)；河北省人民医院普外二科(石晓明、吕柏楠)

吕柏楠，050051 石家庄市，河北省人民医院；

E-mail: shixiaoming1999@126.com

R 753.3+5

A

1002-7386(2014)22-3378-04

2014-05-15)