急性低剂量辐射对小鼠肝脏及骨髓DNA甲基化的影响

陈凤鸣，吴 宏*，张 梦，关雪晶，何晓莉，蒋 林

(重庆医科大学1.基础医学院组织胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室;2.药学院，重庆400016)

随着放射医学在临床诊疗应用的推广和普及，人们受到的辐射危害也逐渐增加。大量既往研究显示高剂量辐射可影响DNA甲基化［1-2］，近年来也有研究发现低剂量辐射可导致DNA甲基化水平改变［3］，但有关低剂量辐射对DNA甲基化影响的研究报道仍相对较少，其与DNA甲基化的关系并不十分清楚。本研究拟从表观遗传学角度探讨低剂量辐射对小鼠肝脏和骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cell，BMNC)DNA甲基化及3种 DNA甲基化转移酶(DNA methyl transferase，DNMT)的影响及可能的分子机制，为辐射防护提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

清洁级成年未交配C57BL/6小鼠，雄性，8～12周龄，体质量18～22 g，由重庆医科大学试验动物中心［合格证号为SYXK(渝)2012-0001］提供。血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根公司)。对照品胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶(Sigma公司)。预染蛋白标准(Thermo Fisher公司)。BCA蛋白浓度测定试剂盒、beta Actin抗体(北京鼎国公司)。兔抗人DNMT1单克隆抗体和兔抗人DNMT3A单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)。兔抗人DNMT3B多克隆抗体(博奥森公司)。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(碧云天公司)。ECL发光液(Millipore公司)。

1.2 实验方法

将小鼠随机分为5组，每组10只，正常组(不做任何处理);辐射组(按辐射后提取标本时间分为1、3、7及14 d组)。采用直线加速器全身均匀照射，总剂量为1.0 Gy，时间为0.39 min，X线吸收剂量率为300 cGy/min，有效面积为25 ×25 cm2，焦点-鼠距为100 cm。并于辐射后眼眶取血，取血后颈椎脱臼处死小鼠取肝脏及BMNC。

1.3 外周血WBC、RBC及PLT计数

常规进行外周血细胞计数。

1.4 小鼠股骨及胫骨BMNC的提取

取双侧股骨及胫骨，PBS冲出骨髓细胞，采用Ficoll-Hypague密度梯度离心法获取BMNC。

1.5 高效液相色谱仪检测肝及BMNC全基因组DNA甲基化水平

取肝脏约30 mg和制备好的BMNC，按照DNA提取说明书进行提取基因组DNA，并用紫外分光光度测得DNA浓度及纯度。采取酸水解法水解DNA，在100 μL(含DNA约20 μg)的DNA 溶液加入70%高氯酸50 μL，在95℃下水解50 min，然后用浓度为1 mol/L 的 KOH 调节 pH 3 ～5，12 000 r/min，离心5 min，取上清滤过，将水解好的样品注入高效液相色谱仪中进行检测，洗脱柱:赛默飞Syncronics色谱柱，以标准品胞嘧啶(cytosine，C)和5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine，5-mC)作为对照，通过公式:5-mC(%)=C5-mC/(C5-mC+Cc)×100%计算基因组DNA甲基化水平。

1.6 蛋白免疫印迹检测 DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的水平

提取蛋白质，蛋白质定量采用BCA法。8%SDSPAGE凝胶电泳，湿法转印PVDF膜，恒流300 mA，DNMT1、DNMT3A 及 DNMT3B 转膜 120 min，5%脱脂奶粉封闭 2 h，与内参、DNMT1、DNMT3A 及DNMT3B一抗、二抗孵育，化学发光、显影、定影。图像保存和分析:Quantity one软件分析条带吸光度值，将目的条带与内参beta actin的吸光度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

所有实验数据均经SPSS 17.0统计软件处理，各组计量资料均以均数±标准差±s)表示，两两比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 辐射后小鼠的基本状况观察

辐射后小鼠毛发光泽、活动度、食量及饮水量均与正常小鼠无异，大便无异常，14 d内无小鼠死亡。

2.2 辐射对小鼠外周血细胞的影响

与正常组相比，辐射组外周血WBC、PLT显著下降(P＜0.05)。WBC在1 d时即降至最低，3 d开始恢复，14 d仍未恢复正常，PLT在1 d开始下降(P＜0.05)，3 d降至最低，7 d开始恢复，14 d仍未恢复正常(P＜0.05)(表1)。

表1 低剂量辐射对小鼠外周血细胞的影响Table 1 The effects of low dose radiation on peripheral blood cells of mice±s，n=5)

表1 低剂量辐射对小鼠外周血细胞的影响Table 1 The effects of low dose radiation on peripheral blood cells of mice±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with normal group．

group WBC(×109/L)RBC(×1012/L)PLT(×109/L)normal 10.12±1.33 9.79±0.96 983±91 radiation 1 day 1.86±0.32* 10.24±0.43 480±47*3 days 3.29±0.55* 9.91±0.50 307±27*7 days 4.45±0.62* 9.74±0.70 462±64*14 days 5.65±0.93* 10.29±0.32 500±32*

2.3 辐射对肝脏及BMNC DNA整体甲基化水平的影响

与正常组相比，辐射组小鼠肝全基因组DNA甲基化水平在1 d时即显著下降(P＜0.05)，3 d恢复至正常。辐射组小鼠BMNC全基因组DNA甲基化水平在1 d即显著下降，在14 d时才恢复至正常(图1，2，3)。

2.4 辐射对肝脏DNA甲基化转移酶的影响

与正常组相比，辐射组肝脏 DNMT1和 DNMT3A的表达显著增高(P＜0.05)，14 d仍未恢复至正常。辐射组DNMT3B在1和3 d的表达显著增高(P＜0.05)，7 d恢复正常(图4)。

2.5 辐射对BMNC甲基化转移酶的影响

与正常组相比，辐射组小鼠BMNC DNMT1和DNMT3A的表达显著增高(P＜0.05)，在14 d仍未恢复至正常。辐射组DNMT3B在1和3 d的表达显著增高(P＜0.05)，7 d恢复正常(图5)。

3 讨论

外周血指标的变化可作为辐射损伤模型是否建立成功的标志之一，本研究结果显示急性X线照射导致小鼠白细胞和血小板计数明显下降，证明急性低剂量辐射损伤模型建立成功。

图1 低剂量辐射对肝脏及BMNC DNA甲基化水平的影响Fig 1 The effects of low dose radiation on DNA methylation of liver and BMNC

图2 标准品胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的色谱图Fig 2 The chromatogram of cytosine and 5-methyl cytosine(the left is cytosine and the right is 5-methyl cytosine)

图3 肝脏及BMNC DNA甲基化水平的色谱图Fig 3 The chromatogram of global DNA methylation level of liver and BMNC

图4 低剂量辐射对肝脏DNA甲基化转移酶的影响Fig 4 The effects of low dose radiation on DNA methyltransferases of liver

图5 低剂量辐射对BMNC DNA甲基化转移酶的影响Fig 5 The effects of low dose radiation on DNA methyltransferases of BMNC

表观遗传学是一种不通过改变DNA序列而调节基因表达的分子现象［4-5］，且对动物细胞分化是必不可少的［6］。DNA甲基化是其主要调控方式之一，它不仅可稳定或锁定静息部位染色体的状态，还对基因印记、X染色体失活、反转录转座子原件的抑制以及动物的正常发育都是必不可少的［7］。肝脏是人体最大的内脏及解毒器官，不仅可调节体内的新陈代谢，还可参与造血及凝血;骨髓可产生各种血细胞的干细胞，对于维持机体生命和免疫力非常重要，DNMT1对造血干细胞维持也是必不可少的［8］。本研究结果表明，与正常组相比较，辐射组小鼠肝脏及BMNC全基因组DNA甲基化水平均显著下降，其后DNA甲基化水平逐渐恢复至正常。辐射导致DNA甲基化改变机制之一可能与DNMT家族表达改变有关。DNMT家族是DNA甲基化的关键调节因子［9］，它是由催化CpG二核苷酸部位甲基化的核酶家族组成［10］。DNMT1的高表达与CpG岛甲基化紊乱有密切关系，它总是伴随着总基因组和癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化［11］。本研究结果显示，与正常组相比，辐射组雄性小鼠肝脏及BMNC DNMT1和DNMT3A表达在照射后第1天即增高，且在14 d时还未恢复;DNMT3B表达同样升高，但是7 d已恢复正常。说明辐射可导致DNMT1表达增加，进而导致CpG岛甲基化紊乱，并最终可导致肿瘤抑制基因表达沉默。

急性X射线照射可导致雄性小鼠肝脏及骨髓BMNC甲基化水平降低及DNMTs表达升高，而全基因DNA甲基化水平降低可能与DNMTs表达的升高有关。基因组整体甲基化水平降低可导致基因组不稳定的发生;DNMTs表达升高可能导致抑癌基因的沉默或癌基因的激活。由于辐射损伤早期的甲基化水平改变是可以逆转的，这为辐射防护剂的开发提供了新的研究思路;而DNMTs表达升高会导致那些基因甲基化水平的改变及基因组DNA甲基化水平改变的具体机制仍不十分清楚，有待我们进一步研究。

［1］Tawa R，Kimura Y，Komura J，et al．Effects of X-ray irradiation on genomic DNA methylation levels in mouse tissues［J］．Radiat Res，1998，39:271-278．

［2］Antwih D A，Gabbara K M，Lancaster W D，et al．Radiation-induced epigenetic DNA methylation modification of radiation-response pathways ［J］．Epigenetics，2013，8:839-848．

［3］Kovalchuk O，Burke P，Besplug，et al．Methylation changes in muscle and liver tissues of male and female mice exposed to acute and chronic low-dose X-ray-irradiation［J］．mutat res，2004，548:75-84

［4］朱亮，刑福祺，全松，等．多囊卵巢综合征大鼠模型LHR、INSR和AR基因甲基化的变化［J］．基础医学与临床，2010，30:63-66．

［5］金铁峰，张美花，林贞花．肿瘤表观遗传学［J］．基础医学与临床，2011，31:204-206．

［6］Jeltsch A．Oxgen，epigenetic signaling，and the evolution of early life［J］．Trends Biochem Sci，2013，38:172-176．

［7］Chen ZX，Arthur D．DNA methylation and demethylation in mammals［J］．J Biol Chem，2011，286:18347-18353．

［8］Mortia R，Hirohashi Y，Suzuki H，et al．DNA methyltranferase 1 is essential for initiation of the colon cancers［J］．Exp Mol Pathol，2013，94:322-329．

［9］Lee JY，Jeong W，Lim W，et al．Hypermethylation and post-transcriptional regulation of DNA methyltransferases in the ovarian-carcinomas of the laying hen［J］．plos one，2013，8:doi:10．1371．

［10］FoulksJM，Parnell KM，Nix RN，et al．Epigenetic drug discovery:targeting DNA methyltransferases［J］．J Biomol Screen，2012，17:2-17．

［11］Hermann A，Gowher H，Jeltsh．Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases［J］．Cell Mol Life Sci，2004，61:2571-2587．