基于磁性微球HCG化学发光免疫检测方法的研究

焦艳华,梁媛媛,郭卫强

(杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)是由胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白激素.HCG分泌量不仅与胎儿正常发育有关，而且还是肿瘤、葡萄胎、毛绒癌等疾病的征兆和避孕疫苗的一个重要指标.因此研究HCG水平的变化具有重要的临床意义，建立简便、快速、灵敏的HCG测定方法是人们研究的焦点[1-3].目前已报道的HCG测定方法中有放射免疫分析[4]、电化学免疫分析[5]、荧光免疫分析[6]和化学发光免疫分析[7-9]等.

磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型功能材料，它是将具有超顺磁性纳米粒子与单体通过聚合的方法制得一种胶态液体复合物，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行各种表面的功能化修饰；而且，它具有超顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离.将磁性高分子微球引入到化学发光检测技术中，不但可以大大提高检测反应的比表面积，而且磁性高分子微球的顺磁性也可以帮助检测的快速分离，缩短检测时间.Zhang等[10]利用磁性微球作为固相载体检测人血清中AFP的含量.通过对59个人血清样本进行检测，与商业化的电化学发光免疫检测试剂盒相比,结果具有良好的一致性.Wang等[11]建立基于磁性微球的化学发光酶免疫法检测糖抗原50(CA50)，检测的线性范围为0～300 U/mL，完成整个操作只需50 min.化学发光磁酶免疫方法具有灵敏度高、线性范围广、特异性高、准确性好等特点[12-13]，采用这种方法进行HCG检测可以达到较高的检测灵敏度.

目前，商业化的磁性微球及配套产品主要依靠进口，价格昂贵，难以在国内大多数中小医院推广使用.因此，磁性微球及检测试剂盒的研制迫在眉睫.本文以本实验室制备的表面富含羧基的磁性高分子复合微球作为免疫检测固相载体，采用EDC/NHS活化磁性微球表面的羧基，并在此基础上将抗β-HCG的抗体固定在磁球表面，制备得到免疫磁性微球.然后以制备得到的免疫磁球为载体，建立基于磁性微球的化学发光免疫检测方法，并研究影响化学发光免疫检测的各项因素.

1 实验部分

1.1 试 剂

丙烯酸，CP，上海五联化工厂；苯乙烯，CP，阿拉丁试剂公司；二联吡啶(BPY)，AR，阿拉丁试剂公司；氯化亚铜，AR，阿拉丁试剂公司；环己酮，AR，杭州高晶精细化工有限公司；EDC上海源叶生物科技公司；NHS上海晶纯试剂有限公司；戊二醛，国药集团化学试剂有限公司；CDP-star，Roche公司；碱性磷酸酶(ALP)，上海源叶生物科技公司；HCG抗原及抗体，北京博奥森科技公司.

1.2 制备方法

1.2.1 磁性微球的制备

Fe3O4磁性粒子的制备及其表面改性方法参照文献进行[14].取100 mL三口烧瓶，加入40 mL环己酮，通氮气15 min，取表面包覆了对氯甲基苯甲酸的纳米Fe3O4磁性粒子1.0 g，BPY 0.35 g，CuCl 0.08 g，苯乙烯6 mL及丙烯酸3 mL.以220 r/min的速度机械搅拌，加热到90 ℃，恒温反应12 h后，冷却到室温，磁性分离，清洗数次，便得到表面富含羧基的聚苯乙烯磁性微球.

1.2.2 酶标记抗体的制备

采用改良的戊二醛法：取碱性磷酸酶0.5 mg和单克隆抗体0.2 mg，分别溶于生理盐水中，混合两液.最终体积控制在0.5 mL，磁力搅拌下，加入0.05 mL1%戊二醛.室温搅拌15 min后，避光反应4 h，加入0.1 mL 1 M的乙醇胺，室温孵育2 h.加入PBS，4 ℃透析过夜，中间换液3次.产物中加入等量甘油和0.1%Proclin-300，分装，冰箱4 ℃存放备用.

1.2.3 免疫磁性微球的制备

取2 mg磁性高分子微球分散在200 μL的PB缓冲液中，加入0.5 mg的EDC和0.5 mgNHS，室温振荡反应15 min，在外加磁场作用下除去上清液，用PB洗涤液洗涤1次.加入200 uL PB缓冲液及150 μg的抗β-HCG抗体，室温摇床振摇2 h，磁性分离，除去上清液，用PBS洗涤3次，加PBS配成一定浓度的免疫磁性微球悬浮液，放入4 ℃冰箱保存待用.

1.2.4 化学发光法检测HCG

取10 μL的免疫磁性微球，加入40 μL的HCG抗原溶液和50 μL的ALP-HCG抗体溶液，摇匀，37 ℃水浴振摇1 h.反应结束后，用PBS洗涤，磁性分离，除去上层清液，重复5次.加入100 μL的化学发光底物CDP-star溶液，混匀，用多功能酶标仪检测其化学发光强度.

2 结果与讨论

2.1 化学发光检测时间的选择

每隔10 min对此发光体系检测一次，从图1中可以看出随着时间的延长，0～30 min内化学发光强度在逐渐增强，这是因为ALP催化AMPPD发光过程分为两个阶段：在ALP的催化下，AMPPD首先脱去一个磷酸基，得到一个AMPD阴离子，然后这个AMPD离子经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一个处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子.激发态的间氧苯甲酸甲酯离子跃迁到基态的过程中会产生光子.而AMPD一般有2～30 min的半衰期，所以当反应超过30 min时，反应的发光强度基本处于稳定状态，继续延长检测时间，反应的光强度也是基本保持不变.因此，为了提高检测速度，检测时间选择在30 min左右较为理想.

2.2 磁微球浓度的选择

免疫磁珠是将抗体等生物活性物质包被在功能化的磁性复合微球上，形成一种可以跟检测目标物质特异性结合的复合磁珠.利用这种磁珠可以检测、分离纯化各种抗原、抗体、蛋白、核酸等生命活性物质，在生物学中的应用相当广泛.

从图2可以看出随着免疫磁性微球浓度的增加，化学发光强度迅速增加.当磁珠浓度达到5 mg/mL时，发光强度达到最大.若进一步加大磁珠使用浓度时，化学发光强度会降低，这是因为磁微球悬浊液会吸收穿过溶液的光，浓度越高吸收越多，磁微球的浓度超过5 mg/mL后，化学发光强度开始减弱.因此，为保证检测时的发光强度, 实验中选择磁性微球的量为5 mg/mL.

图1 检测时间的选择

图2 免疫磁珠的浓度对发光强度的影响

2.3 酶标抗体浓度的影响

首先将ALP标记的anti-βHCG抗体溶液依次稀释到12 mg/L、6 mg/L、3 mg/L、1.5 mg/L、0.75 mg/L.取10 μL的免疫磁性微球，加入300 IU/L的HCG抗原溶液40 μL，然后加入以上不同浓度的酶标抗体溶液50 μL，混匀，室温孵育60 min，清洗5次，然后加入发光底物检测化学发光强度，结果如图3所示.实验结果表明，当反应体系中无ALP-HCG抗体时，发光强度很低，随着ALP-HCG抗体浓度的增加，发光强度迅速增强，但是到6 mg/L后几乎不再增加.因此实验中选择ALP-HCG的浓度为6 mg/L.

2.4 反应孵育时间的选择

固定HCG抗原的浓度为200 IU/L，酶标抗体浓度为6 mg/L，磁微球加入量为50 μg时，将反应孵育时间设定为10 min，20 min、40 min、50 min、60 min、90 min，检测反应孵育时间对发光强度的影响，结果如图4所示.从图4可以看出，开始随着孵育时间的延长，化学发光强度是增强的，但到了60 min后化学发光强度不再增强，因此合适的反应孵育时间为60 min.

图3 酶标抗体浓度的影响

图4 孵育时间对发光强度的影响

2.5 HCG标准曲线的绘制

用PBS溶液对HCG原液进行梯度稀释, 形成不同浓度的HCG 溶液，在最优化的配比和检测条件下, 对0.5～300 IU/L的HCG 样品进行检测得知，HCG浓度与检测发光强度呈线性关系(如图5所示).其检出限为0.32 IU/L,线性范围为0.5～300 IU/L，线性方程为y=1.0464x+297.91，标准曲线的线性相关系数为r=0.990，线性较好，线性范围较宽.

图5 HCG浓度与发光强度的线性关系

3 总 结

将化学发光方法的灵敏性、磁分离技术的快速性和酶免疫分析的特异性结合在一起，建立一种磁酶联化学发光免疫分析方法，并对检测条件进行了优化.在磁性高分子微球的表面偶联上抗β-HCG的抗体得到免疫磁珠，用来检测HCG，绘制了HCG标准曲线，线性关系为y=1.0464x+297.91，线性相关系数为r=0.990，线性较好，线性范围较宽.这种检测方法操作简便，检测时间大大缩短，重现性良好，可自动化程度高.

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