15种竹叶中碳苷黄酮的含量研究

， ， ，

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032)

竹子是禾本科(Poaceae),竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，在我国具有悠久的食用和药用历史.全世界竹子约有70多属、1 250多种，其中53%分布在中国.竹叶黄酮是一种有独特天然竹香的天然抗氧化剂，其抗氧化作用可替代银杏提取物、茶叶提取物和葡萄籽提取物，已列入国标GB 2760-2011，被卫生部批准作为天然食品抗氧化剂使用.竹叶黄酮具有清除自由基、抗氧化、防衰老和预防老年痴呆[1]，抗炎[2-3]，杀菌[4-6]，预防癌症，抗肿瘤增殖[7]，降低血糖[8]，降低心脑血管疾病发生的危险[9]等多种生物学功效.研究表明竹叶含有相当高含量的碳苷黄酮，如荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷(本实验室采用LC-DAD-MS/MS技术鉴定)、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷[10].然而，刚竹属不同品种竹叶中6种碳苷黄酮含量方面的研究还没有报道，为找到富含竹叶黄酮的竹类资源，本研究建立测定6种碳苷黄酮的HPLC法，对刚竹属15种竹子中的碳苷黄酮进行定量分析，为充分开发利用富含碳苷黄酮的竹类资源提供科学基础.

1 仪器与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，SENCO旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)，YP202N电子天平(上海森信实验仪器有限公司)，FD-2密封式恒温可调电加热器(嘉兴市欣欣仪器设备有限公司).15种刚竹属(PhyllostachysSieb.etZucc)竹叶(P.pubescens,P.vivax,P.arcana,P.nidularia,P.rubicunda,P.aurea,P.meyeri,P.circumpilis,P.acuta,P.bambusoides,P.tianmuensis,P.glauca,P.rubromarginata,P.heterocycla,P.nigra)于2012年10月采自浙江安吉竹博园.标准品荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷购自上海同田生化有限公司，色谱纯乙腈和甲醇购自美国TEDIA天地试剂公司，水为超纯水，其他试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，样品进样前均经0.22 μm微孔滤膜滤过.

2 实验方法

2.1 色谱条件及系统适应性试验

Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相混合溶剂A(乙腈)和溶剂B(体积分数0.2%乙酸水)梯度洗脱条件：10% A(34 min)，10%～13% A(34～52 min),13%～15% A(52～85 min)；15%～10% A(85～90 min)；流速1.0 mL/min；检测波长330 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL.在上述色谱条件下，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷色谱峰与相邻色谱峰分离度大于1.5(图1)，理论塔板数均大于5 000.

1—荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷；2—荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷；3—异荭草苷；4—荭草苷；5—牡荆苷；6—异牡荆苷

2.2 标准品溶液的配置

荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷和荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷标准储备液用甲醇溶解，质量浓度分别为99.2,76.6,68.8,77.0,79.4和84.3 μg/mL的标准溶液.系列标准溶液的制备是通过移取一定量标准储备溶液至10 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=15∶85稀释至刻度，其质量浓度范围为0.20～100 μg/mL，8个梯度质量浓度.

2.3 样品溶液的制备

取新鲜干燥竹叶置50 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎成细粉.精密称取1.0 g竹叶干燥粉末置100 mL具塞单口瓶中，加入70%甲醇15 mL，浸润2 h，室温超生提取1 h，经离心(4 000 r/min,5 min)后取上清液.按照上述步骤残渣进一步用70%甲醇萃取2次(时隔40 min)，合并所有的提取液，在真空下浓缩后转移至50 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解并稀释至刻度，4 ℃保存.样品进样前均经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用.

2.4 方法学验证

HPLC色谱梯度条件优化之后，通过线性关系考察、最低检测限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度和准确性等方面进行方法学验证.

3 结果与讨论

3.1 HPLC方法学验证

HPLC色谱方法通过最低检测限、定量限、线性关系、日内精密度、日间精密度、重复性和准确性等方面进行方法学验证，6种碳苷黄酮的最低检测限范围为0.003 5～0.146 5 μg/mL，最低定量限的范围为0.012 4～0.493 9 μg/mL，保留时间(tR)和峰面积(PA)的RSD分别低于0.19%(tR)，3.36%(PA).方法的重复性RSD低于2.91%，其准确性即回收率范围为97.9%～101.0%.6种碳苷黄酮的线性关系、线性范围、相关系数如表1所示，所有化合物的相关系数(r2)均大于0.999 7.上述结果表明：本研究所建立的同时，检测竹叶中6种碳苷黄酮的HPLC方法，结果准确可靠.

表1 黄酮类化合物的线性关系

3.2 样品测定

刚竹属15种竹叶按照2.3项下方法制备成供试样品，于2.1项色谱条件下进样检测，其结果如表2所示.15种竹叶样品中荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷及其6种碳苷黄酮的总量的质量分数范围分别为：27.5～233.5，15.9～192.9，132.9～953.4，47.6～331.6，9.8～153.0，2.9～179.5，480.7～1 719.9 μg/g.分析结果表明：毛竹、淡竹、天目早竹、龟甲竹和斑竹富含竹叶黄酮类化合物，以毛竹叶中碳苷黄酮的质量分数为最高，达到1 719.9 μg/g.

表2 刚竹属15种竹叶中6种黄酮的质量分数1)

4 结 论

竹叶碳苷黄酮具有清除自由基、抗氧化、降血糖、抗炎、杀菌、保肝、护肝、保护心脑血管系统等多种生物学功效，因此以竹叶中6种碳苷黄酮的含量为指标，建立的HPLC-UV法同时测定15种竹叶中6种碳苷黄酮的含量，具有科学性且操作简便、结果准确可靠，可被广泛使用.分析结果表明：毛竹、淡竹、天目早竹、龟甲竹和斑竹5种竹子富含碳苷黄酮类化合物,可作为碳苷黄酮的主要来源.这种方法为竹叶资源的深层次开发和综合利用提供了一定的研究基础，对促进我国农林产业的发展具有重大的指导意义.

参考文献：

[1]HU Chun， ZHANG Ying， KITTS D D. Evaluation of antioxidant and prooxidant activities of bambooPhyllostachysnigraVar.Henonisleaf extract in vitro[J]. J Agric Food Chem，2000，48(8)：3170-3176.

[2]钱俊青，吴宏君，金再宿，等．竹醋液的抗炎活性研究[J]．浙江工业大学学报，2012，40(6)：623-625．

[3]KOIDE C L K， COLLIER A C， BERRY M J， et al． The effect of bamboo extract on hepatic biotransforming enzymes-Findings from an obese-diabetic mouse model[J]. J Ethnopharmacol，2011，133(1):37-45.

[4]钱俊青，张培培，浅海均，等．竹醋液馏分杀菌效果的研究实验[J]．浙江工业大学学报，2007，35(6)：609-612．

[5]张英.竹叶黄酮的生理与药理活性[J]．世界竹藤通讯，2004，2(2)：1-10.

[6]邬国胜，李敏，浅海均．竹醋液抑菌活性及其稳定性研究[J]．浙江工业大学学报，2011，39(1)：44-46．

[7]SEKI T, MAEDA H. Cancer preventive effect ofKumaizasabamboo leaf extracts administered prior to carcinogenesis or cancer inoculation[J]. Anticancer Res，2010，30(1):111-118.

[8]FOLADOR P， CAZAROLLI L H, GAZOLA A C， et al． Potential insulin secretagogue effects of isovitexin and swertisin isolated from Wilbrandia ebracteata roots in non-diabetic rats[J]. Fitoterapia，2010，81(8):1180-1187.

[9]SESSO H D, GAZIANO J M, LIU S， et al． Flavonoid intake and the risk of cardiovascular disease in women[J]. Am J Clin Nutr,2003，77(6):1400-1408.

[10]ZHANG Yu， JIAO Jing-jing, LIU Cheng-mei， et al． Isolation and purification of four flavone C-glycosides from antioxidant of bamboo leaves by macroporous resin column chromatography and preparative high-performance liquid chromatography[J]. Food Chem,2008，107(3):1326-1336.