牡荆素对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞损伤的影响及机制*

赵 宏，李登科，马红利

（1.江苏省南京大学医学院附属泰康仙林鼓楼医院超声与功能检查科（心功能室），南京 210000；2.兰州大学第一医院东岗院区（中西医结合科），兰州 730030；3.湖北省荆州市中心医院（心功能室），荆州 434020）

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌急性或慢性炎症病变，以心肌细胞坏死、凋亡、间质炎性细胞浸润为主要改变[1-2]。目前，病毒性心肌炎无特异性治疗方法，多以针对病毒感染和心肌炎症治疗为主，近年来多项研究表明，中医药在病毒性心肌炎的治疗中取得了显著的疗效[3-4]。病毒性心肌炎的致病病毒为柯萨奇B 组（CVB）病毒，其中CVB3具有强嗜心性，因此目前多利用CVB3 感染心肌细胞构建病毒性心肌炎细胞模型[5]。本研究选择人心肌细胞株AC-16为研究对象，建立病毒性心肌炎细胞模型，研究牡荆素对CVB3 感染的心肌细胞凋亡和炎症的影响及其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人心肌细胞AC-16 购自美国ATCC；牡荆素购自成都普菲德生物技术有限公司；CVB3 病毒株由上海中山医院病毒性心肌炎实验室提供；DMEM/F12 培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司；MTT 试剂购自美国Sigma 公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；实验用抗体均购自上海生工生物工程有限公司；人白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒和肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 AC-16细胞培养

将AC-16 细胞加入含10 %胎牛血清和1%青霉素和链霉素混合液的DMEM/F12完全培养液中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞生长至60%～70%融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代培养。取对数生长期的AC-16 细胞进行后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 CVB3病毒性心肌炎心肌细胞模型建立将对数生长期的AC-16细胞，进行消化、计数，制成2×106个/mL 的单细胞悬液，接种于96 孔培养板中，每孔100µL；将细胞分为5组：正常组、病毒组、牡荆素低剂量组（10 mg/kg）、牡荆素中剂量组（30 mg/kg）和牡荆素高剂量组（50 mg/kg），置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24～48 h，然后分别在病毒组和牡荆素各剂量组加入含103TCID50毒力的CVB3病毒的DMEM/F12培养液，孵育2 h后，正常组和病毒组分别加入含2%胎牛血清的DMEM/F12 培养液，牡荆素低、中、高剂量组分别加入等量含2%胎牛血清及终浓度分别为10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg的牡荆素的DMEM/F12 培养液，继续培养48 h，构建病毒性心肌炎细胞模型。

1.3.2 MTT 法检测各组细胞增殖活性 将“1.3.1”项中各组细胞培养孔中培养液吸除，分别加入90µL新鲜的完全培养液和10µL的MTT溶液，培养4 h；弃上清，每孔加入100µL 二甲基亚砜，轻轻震荡培养10 min。酶标仪上检测每孔490 nm 处吸光度值（OD值）。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡取“1.3.1”中各组细胞，加入胰酶消化后，离心收集细胞，使用预冷的PBS 溶液冲洗细胞。参考Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明，重悬细胞，然后分别加入5µLAnnexin V-FITC和5µLPI，室温避光染色15 min。流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

1.3.4 Western blotting 实验检测Bcl-2、Bax 蛋白表达 离心收集各组细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取适量蛋白样品放入沸水浴中加热3～5 min，使蛋白充分变性，然后进行SDS-PAGE 分离目的蛋白；转膜至硝酸纤维素膜（NC膜），加入5%脱脂奶粉封膜2 h；PBS洗膜，加入稀释后的Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，然后加入稀释的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1 000)，摇床上缓慢摇动孵育1 h；洗膜，加入ECL 发光液染色，显微镜下曝光、拍照。

1.3.5 ELISA 法检测细胞培养液中IL-1β 和TNF-α的表达 离心收集各组细胞的培养上清液，参照IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒说明书，检测培养上清液中IL-1β和TNF-α的水平。

1.4 统计学方法

所有实验均进行3 次重复，采用SPSS19.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牡荆素对CVB3感染心肌细胞增殖的影响

与正常组比较，病毒组心肌细胞增殖活力明显降低（P＜0.05）；与病毒组比较，牡荆素低、中、高剂量组心肌细胞增殖活力均明显升高（P＜0.05），其中牡荆素中、高剂量组心肌细胞增殖活力明显高于牡荆素低剂量组（P＜0.05），而牡荆素中、高剂量组心肌细胞增殖活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。说明牡荆素能够促进CVB3 感染心肌细胞的增殖能力。

表1 MTT法检测各组细胞OD值

表1 MTT法检测各组细胞OD值

与正常组比较，aP＜0.05；与病毒组比较，bP＜0.05；与牡荆素低剂量组比较，CP＜0.05。

2.2 牡荆素对CVB3感染心肌细胞凋亡的影响

与正常组比较，病毒组心肌细胞的细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与病毒组比较，牡荆素低、中、高剂量组心肌细胞的细胞凋亡率均降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见图1 和表2。说明牡荆素能够抑制CVB3诱导的心肌细胞凋亡。

2.3 牡荆素对CVB3 感染心肌细胞凋亡相关蛋白的影响

与正常组比较，病毒组心肌细胞中Bcl-2 蛋白相对表达水平降低，Bax 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与病毒组比较，牡荆素低、中、高剂量组心肌细胞中Bcl-2蛋白相对表达水平均升高，Bax蛋白相对表达水平均降低（P＜0.05）；其中牡荆素中、高剂量组心肌细胞中Bcl-2蛋白相对表达水平明显高于牡荆素低剂量组，Bax 蛋白相对表达水平明显低于牡荆素低剂量组（P＜0.05），而牡荆素高剂量组心肌细胞中Bax蛋白相对表达量明显低于牡荆素中剂量组（P＜0.05），见图2和表3。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

表2 各组细胞凋亡率比较%，

表2 各组细胞凋亡率比较%，

与正常组比较，aP＜0.05；与病毒组比较，bP＜0.05；与牡荆素低剂量组比较，cP＜0.05；与牡荆素中剂量组比较，dP＜0.05。

2.4 牡荆素对CVB3感染心肌细胞炎症的影响

与正常组比较，病毒组心肌细胞培养上清液中IL-1β 和TNF-α 水平均升高（P＜0.05）；与病毒组比较，牡荆素低、中、高剂量组心肌细胞细胞培养上清液中IL-1β 和TNF-α 水平均降低（P＜0.05），其中牡荆素中、高剂量组心肌细胞培养上清液中IL-1β 和TNF-α水平明显低于牡荆素低剂量组（P＜0.05），牡荆素高剂量组心肌细胞培养上清液中IL-1β和TNFα 水平明显低于牡荆素中剂量组（P＜0.05），见表4。说明牡荆素能够减轻CVB3 诱导的心肌细胞炎症反应。

图2 Western blotting检测Bcl-2、Bax蛋白的相对表达量

表3 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平比较

表3 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平比较

与正常组比较，aP＜0.05；与病毒组比较，bP＜0.05；与牡荆素低剂量组比较，cP＜0.05；与牡荆素中剂量组比较，dP＜0.05。

表4 各组细胞培养上清液中IL-1β和TNF-α水平比较

表4 各组细胞培养上清液中IL-1β和TNF-α水平比较

与正常组比较，aP＜0.05；与病毒组比较，bP＜0.05；与牡荆素低剂量组比较，CP＜0.05；与牡荆素中剂量组比较，dP＜0.05。

2.5 牡荆素对CVB3感染心肌细胞中p38 MAPK通路的影响

与正常组比较，病毒组心肌细胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与病毒组比较，牡荆素低、中、高剂量组心肌细胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相对表达水平均降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见图3 和表5。说明牡荆素能够抑制CVB3 诱导的心肌细胞中p38 MAPK信号通路激活。

图3 Western blotting 检测p38 MAPK、p-p38 MAPK 蛋白的相对表达量

表5 各组p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相对表达水平比较

表5 各组p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相对表达水平比较

与正常组比较，aP＜0.05；与病毒组比较，bP＜0.05；与牡荆素低剂量组比较，cP＜0.05；与牡荆素中剂量组比较，dP＜0.05。

3 讨论

中医认为病毒性心肌炎属“温热”、“心悸”等范畴，多认为素体正气不足，温热毒邪侵袭肺、心，导致心之气血失调，兼见淤血、湿阻、痰浊等多种病理产物停积，是其主要病因[6-7]。牡荆素是一类从牡荆叶和牡荆子中提取的黄酮类化合物，其主要功效是活血化瘀、理气通脉，具有抗心肌缺血再灌注损伤、抗缺血性神经损伤及抗肿瘤等多种功能[8-10]。已有研究表明，牡荆素对CVB3 诱导的病毒性心肌炎大鼠心肌损伤具有保护作用[11]。但目前牡荆素保护病毒性心肌细胞损伤的作用及机制尚不完全清楚。

本研究利用CVB3体外诱导构建人病毒性心肌炎细胞模型，结果发现牡荆素能够有效改善CVB3诱导的心肌细胞增殖活性降低，促进心肌细胞增殖（P＜0.05）；流式细胞仪检测结果显示，CVB3 诱导心肌细胞凋亡明显增加，而牡荆素能够有效抑制心肌细胞凋亡（P＜0.05）。Bcl-2和Bax是细胞凋亡相关基因，Bcl-2 是细胞凋亡抑制基因，Bax 不能拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促进细胞凋亡的功能[12]。本研究Western blotting 实验结果也表明，CVB3诱导心肌细胞中促凋亡作用的Bax基因表达增加，而Bcl-2基因表达减少，牡荆素则能逆转这种现象（P＜0.05）。说明牡荆素能够促进CVB3 诱导的心肌细胞增殖，并抑制心肌细胞凋亡，对CVB3诱导的心肌细胞损伤具有保护作用。

炎症反应是病毒性心肌炎的主要病症之一，在病毒性心肌炎发生及后续心肌重构、心律失常、心力衰竭等病理变化中具有重要作用[13]。因此，抑制心肌炎症反应是保护心肌损伤，减缓或阻止病毒性心肌炎进展的重要措施。IL-1β 和TNF-α 是炎症反应中主要的炎性细胞因子，韦迎娜等[14]研究表明，槲皮素可减弱CVB3诱导的乳鼠心肌组织和心肌细胞中IL-1β、TNF-α水平，减轻炎症反应，提高小鼠存活率。杨怡侠等[15]研究表明，黄芪三萜皂苷可抑制CVB3诱导的小鼠心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，减少小鼠心肌损伤面积，提高小鼠存活率。本研究结果显示，CVB3诱导人心肌细胞中IL-1β 和TNF-α 水平升高，而牡荆素能够抑制CVB3 诱导的IL-1β和TNF-α水平升高（P＜0.05）。说明牡荆素能够抑制CVB3诱导的人心肌细胞炎症反应。

p38 MAPK 信号通路是MAPK 家族成员，在一些环境压力和炎症细胞因子刺激下可被激活，参与多种生理和病理反应过程。研究表明，在病毒性心肌炎早期存在p38 MAPK 信号通路活化，可能参与其病理过程[16-17]。本研究结果显示，CVB3能够诱导人心肌细胞中p-p38 MAPK 表达增加，而牡荆素对p-p38 MAPK 具有明显的抑制作用（P＜0.05），提示牡荆素对CVB3诱导的心肌细胞的保护作用可能与抑制p38 MAPK通路活化有关。

综上所述，牡荆素对CVB3 诱导的人心肌细胞的损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制p38 MAPK通路活性有关，为牡荆素在病毒性心肌炎临床治疗中的应用提供了实验参考。