血浆let-7c在烟雾病中的表达变化及意义

赵绍云 龚 哲 张 静 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕军放 贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

血浆let-7c在烟雾病中的表达变化及意义

赵绍云 龚 哲 张 静 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕军放 贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

目的 探讨烟雾病(MMD)患者血清let-7c的表达变化及意义。方法 实验组选择MMD患者29例，对照组选择正常健康人群29例，脑出血15例，大面积脑梗死20例，非大面积脑梗死18例，神经免疫性疾病31例。应用实时荧光定量PCR检测各组血清let-7c表达水平。结果 实时荧光定量PCR表明，MMD患者血清let-7c的表达水平较对照组、非大面积脑梗死、大面积脑梗死、脑出血、神经免疫性疾病患者增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 烟雾病患者中血清let-7c表达上调，为其诊断提供潜在的新生物学标记物。

烟雾病；let-7c；PCR

烟雾病(Moyamoya disease，MMD)于1957年Takeuchi和Shimizui首次描述，是一种原因不明表现为床突上段颈内动脉及其Willis环的主要分支进行性严重狭窄直至闭塞为主要特征的特发性疾病，其发病机制尚不清楚。流行病学显示，本病亚洲多发，6%～10%患者有一定家族史，10岁以下小儿和40岁左右成人是其两个发病高峰。

微小RNA(miRNA)是一种大小为22 nt左右的非编码单链小分子，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，是调控基因表达的关键因子[1]，广泛参与了机体的各种调节途径。已在多种疾病中相继发现miRNA可能作为潜在的生物标记物[2-4]，用于临床诊断和疾病预后判断等方面。let-7家族是最早发现的miRNA 之一，有13位成员，其中let-7c在肿瘤、炎症等发生中有一定作用[5]，可能成为某些疾病的潜在生物标志物。本研究初步探索let-7c在烟雾病患者血清中表达变化及其意义[6]。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2013-09—2014-07就诊于郑州大学第一附属医院门诊及住院治疗患者。按照1997年修订的Moyamoya病诊断标准，选取烟雾病患者29例为实验组，男15例，女14例，平均年龄(45±13.74)岁；其中脑出血5例，非大面积脑梗死10例，大面积脑梗死5例，无脑梗死或脑出血9例，无感染、肿瘤、自身免疫性疾病等并发症。对照组29例，男15例，女14例，平均年龄(45±4.81)岁；无脑血管疾病，感染、肿瘤、自身免疫性疾病等并发症；脑出血患者15例(脑出血组)，男8例，女7例，平均年龄(48±9.90)岁；无感染、肿瘤、自身免疫性疾病。大面积脑梗死患者20例(大面积脑梗死组)，男12例，女8例，平均年龄(50±5.22)岁；非大面积脑梗死患者18例(非大面积脑梗死组)，男9例，女9例，平均年龄(48±10.70)岁；神经免疫性疾病31例(神经免疫性疾病组)，男16例，女15例，平均年龄(43±8.37)岁；其中多发性硬化10例，视神经脊髓炎5例，多发性肌炎8例，重症肌无力8例。各组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P<0.05)，具有可比性。所有患者均通过病史、影像学及实验室检查等确诊。分别收集入组患者及健康正常人血液标本。该实验由郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，并获得所有受试者或其委托人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 取材： 用普通生化管抽取实验组及对照组外周静脉血2 mL，于4℃，RCF(1 000～1 200)×g条件下离心10 min，取上层血清，分装在已灭菌的EP管内，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 提取血清中的miRNA：按miRNA Purification Kit miRNA 提取试剂盒(康为世纪 )说明书手工提取血清miRNAs。

1.2.3 通过实时定量PCR对血清中的miRNA进行定量：按照Reverse Transcription System( Promega 公司) 说明书，将microRNA逆转录为cDNA,其反应的总体积为20 μL。按照GoTaq qPCR Master Mix 荧光定量检测试剂盒说明书进行荧光定量检测，以5 s为内参。Let-7c及内参特异性的引物序列参照miRBase database，由广州锐博生物公司合成。每个扩增反应体系为20 μL，每例样本重复检测3次。应用LightCycler1.5定量PCR仪(Roche公司)进行实时定量PCR检测。检测miRNA的相对表达定量时，采用2-△△法进行结果分析，将各组的相对表达定量值(relative quantity，RQ)进行比较，RQ=2-△△，△△Ct=待测标本的△Ct-对照样本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 19.0统计学软件处理,计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，组间两两比较用LSD-t检验或Bonferroni法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时定量PCR检测结果及实验组与对照组的血清let-7c相对表达量 各实验组、对照组人群血浆中let-7 c及5 s的实时荧光定量PCR扩增曲线均呈“S”型；PCR产物溶解曲线均为单峰，说明扩增的目的基因特异性好且结果可靠。

表1 各组血清let-7 c表达水平

2.2 各组血清let-7c表达水平 实时定量PCR检测实验组、大面积脑梗死组、非大面积脑梗死组、神经免疫性疾病组、正常健康人群组的let-7 c的相对表达量，见表1。结果显示，MMD患者血清let-7 c的表达水平较正常健康人群、大面积脑梗死、神经免疫性疾病升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；血清let-7 c在非大面积脑梗死、脑出血患者中的表达水平较MMD患者降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；但较正常健康人群升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

烟雾病(MMD)患者常以脑出血或缺血起病。成人烟雾病以脑出血为主要损害表现，多因为血管负荷加重、异常新生血管网血管壁压力过高破裂、微小动脉瘤破裂等引起。而当颅内大血管狭窄引起血流供应减少，当代偿扩张及侧支循环不能满足脑组织需要时，可发生脑梗死。

现烟雾病诊断主要依靠DSA、MRA、CTA等影像学检查资料，尚无其他相关特异实验室检查指标。近年来血浆/血清中的miRNA在疾病中的作用与诊断价值引起人们的关注[7]，其性质非常稳定[8]，即使在100℃煮10 min或室温放置数小时、-80℃和室温下反复冻融，血浆表达水平基本不变。MMD病因不明，危险因素可能包括遗传因素、炎症、感染、自身免疫反应等，本研究通过检测不同人群的血清let-7c的表达水平，可发现较脑出血、大面积脑梗死、非大面积脑梗死、神经免疫性疾病及正常健康人，MMD患者表达水平升高，提示血清let-7c可能为该疾病诊断的潜在新生物学标记物。

Let-7c嵌于长非编码基因LINC00478，作用于许多靶基因，如TRIB2、BUB1, RAS、MYC、RTCD1、TGFBR1等[9]。C-MYC是一种多功能、核内磷酸化蛋白，参与了细胞周期进程、凋亡等过程[10]。Ras蛋白控制了参与细胞质骨架整合、细胞增殖、分化、黏附、凋亡、转移等过程的细胞内信号转导网络[11]。MED28可能参与与平滑肌细胞分化调控过程,也能通过作用于表皮生长因子(EGF)影响肿瘤迁移[12-13]。RTCD1通过调控rRNA合成等参与细胞增长、细胞大小的调节。多种研究表明，let-7c通过作用于原癌基因，产生抑癌作用，已提出的作用位点有Ras/NF-κB、TRIB2[14]、Bcl-xl 、IGF1R[15-16]、ITGB3 和 MAP4K3[17]等。Let-7c能直接抑制Bcl-xl表达导致内皮细胞凋亡[18]。IGF1R、MAP4K3、Bcl-xl与mTOR信号通路相关，mTOR信号通路对血管生成、细胞迁移和血管新生与再生发挥一定作用。推测let-7c可能通过血管内皮细胞、平滑肌细胞调节与烟雾病相关的重要基因影响MMD患者血管新生与重建。有研究称，miRNAs被运输到微泡，并致使受体细胞基因沉默，微泡中的成胶质细胞瘤衍生的RNA可被吸收入脑微血管内皮细胞(HBMVEC)并发挥作用，let-7c也可能通过该方式调节烟雾病相关基因。

本研究表明烟雾病患者中血清let-7c表达上调，可能为该疾病诊断提供潜在的新生物学标记物。但let-7c表达水平与MMD发生发展之间是否可能有进一步的深层次关系，仍需进一步深入研究。

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(收稿2014-05-20)

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1673-5110(2014)23-0028-03