α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与Rho GTPases信号通路的活化相关

丁雪冰 王雪晶 马明明 滕军放

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省神经系统分子构象病分子诊断实验室 郑州 450052 3)河南省人民医院神经内科 郑州 450003

α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与Rho GTPases信号通路的活化相关

丁雪冰1，2)王雪晶1，2)马明明3)滕军放1，2)

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省神经系统分子构象病分子诊断实验室 郑州 450052 3)河南省人民医院神经内科 郑州 450003

目的 探讨α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡的分子机制。方法 构建α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型，流式细胞技术检测SH-SY5Y细胞凋亡；免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内α-Syn阳性包涵体；Pull down检测SH-SY5Y细胞Rac1、Cdc42、RhoA活性。结果 与对照组相比，α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡率显著增加，细胞内α-Syn阳性包涵体数量增加，Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。结论 α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与Rho GTPases信号通路的活化相关。

Rho GTPases信号通路；α-突触核蛋白；人神经母细胞瘤细胞；凋亡

帕金森病(Parkinson’s Disease， PD)病理特征为多巴胺神经元胞浆中α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)阳性路易小体的形成及多巴胺神经元的缺失[1]。目前，帕金森病的发病机制尚不明确，研究发现DA神经元大量吞噬异常聚集的α-Syn后，启动自身凋亡程序，并激活周围小胶质细胞释放大量氧自由基及炎性因子，导致DA能神经元的损伤[2-3]。推测α-Syn阳性包涵体在神经元间的播散在PD进展中起到重要作用。

Rho GTPase具有GTP激酶活性，在活性型(GTP限制型构象)和失活型(GDP限制型构象)之间循环，参与调节细胞骨架解聚的动态过程，重塑细胞形态，从而影响细胞吞噬功能[4]。其中Rac1、Cdc42和RhoA是关键的调控因子。在神经细胞和巨噬细胞中，RhoA的活化导致突起回缩、胞体变圆，Cdc42的激活促进丝状伪足的形成，Rac1的激活促进板装伪足的形成。研究表明，在多种细胞成熟过程中，活化型Rac1、Cdc42的水平参与调节细胞吞噬作用，细胞成熟后Cdc42的活化降低，吞噬现象消失[5]。提示Rho GTPase信号通路的调控因子在细胞吞噬功能中发挥重要的作用。

本研究试图以α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡为切入点，检测α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡过程中Rho GTPases信号通路的活性，探索PD神经元凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM培养基、胎牛血清购于美国GIBCO公司。α-Syn抗体购于美国 Santa Cruz Biotechnology公司，过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于美国Promega公司，Alexa Fluor 633 标记 Phalloidin购于美国Molecular Probes公司。DAPI购于美国Molecular Probes公司。细胞裂解液购于美国Cell Signaling公司。Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD，agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD，agarose) 购于美国Millipore公司。人源重组α-Syn冻干粉购于Sigma公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展公司)。

1.2 α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型的构建 SH-SY5Y细胞以1×106接种并培养24 h后，换无血清培养基，实验组中加入终浓度0.5μm的α-Syn寡聚体，对照组加入相应体积PBS，并于37℃ 5% CO2中孵育24 h。

1.3 流式细胞技术检测SH-SY5Y细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染法分组处理后,流式细胞仪分析细胞凋亡。0.25%胰蛋白酶消化细胞后PBS洗涤3次，收集5×105个细胞，加入500 μL Binding Buffer及5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI混匀，反应10 min，用美国BD公司流式细胞仪进行数据分析。

1.4 免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内α-Syn阳性包涵体 收获SH-SY5Y细胞，PBS洗2次。加入-20℃预冷的丙酮于-20℃孵育10 min，加入0.1% Triton，常温孵育5 min。5% BSA 37℃孵育30 min。加入α-Syn抗体(1∶1000)4℃孵育过夜，PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488 标记羊抗兔二抗(1∶1 000) 4℃孵育3 h，PBS洗3次。加入DAPI(1∶400)，常温孵育3 min。于干净的载玻片滴加封片剂，常温下避光晾干过夜，于激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 Western blot检测SH-SY5Y细胞GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA蛋白表达 以含蛋白酶抑制剂的裂解液提取细胞总蛋白，90 mA恒流SDS电泳；90V恒压转膜120 min，将蛋白转至硝酸纤维膜。于含5%脱脂奶粉的TBST封闭液常温封闭常温孵育1 h。4℃分别孵育GTP-RhoA、GTP-Rac1及GTP-Cdc42 (1∶1 000)过夜，TBST洗膜10 min 3次。常温孵育过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶5000) 1 h，TBST洗膜10 min 3次。TBST洗膜10 min 3次，ECL光化学法显色。凝胶成像系统分析扫描。

1.6 Pull down检测Rac1、Cdc42、RhoA活性 0.5 mL预冷的细胞裂解液MLB裂解细胞10 min，离心收集上清。加入GST(100 μL/1 mL细胞裂解液)，冰上孵育10 min，离心去除GST，收集上清。冰上取1 mL细胞提取液加入离心管中，并在离心管中加入20 μL Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD，agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD，agarose)冰上孵育2 h。离心去上清。500 μL Wash Buffer 洗涤沉淀，离心去上清。沉淀所得蛋白做Western blot 分析检测GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA蛋白表达。

2 结果

2.1 流式细胞技术检测SH-SY5Y细胞凋亡 Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡率显著增加。如图1所示。

注:与 PBS对照组比较，**P<0.05

图1 流式细胞技术检测SH-SY5Y细胞凋亡的变化

2.2 免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内α-Syn阳性包涵体 α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型。免疫荧光结果显示，与对照组相比，α-Syn诱导SH-SY5Y细胞中α-Syn阳性包涵体数量增多。如图2所示。

图2 免疫荧光检测SH-SY5Y细胞中α-Syn阳性包涵体(免疫荧光×400)

2.3 Pull down检测Rac1、Cdc42、RhoA活性 α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型。Pull down及Western blot检测结果显示，与对照组相比，α-Syn诱导SH-SY5Y细胞中GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA表达水平增高。表明Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。如图3所示。

3 讨论

最近的研究提出，PD的病理生理过程可能与α-Syn阳性路易小体在中枢神经系统细胞间的播散有关[6]。研究发现，α-Syn寡聚体可以像“朊蛋白”一样作为“种子”诱导正常构象的α-Syn蛋白错误折叠并成核聚集，在细胞内颗粒状聚集，最终形成α-Syn阳性包涵体[7]。通过这种模式α-Syn阳性包涵体在细胞间播散通过这种模式α-Syn阳性包涵体在细胞间播散，导致神经元的损伤从黑质向其他脑区扩散。而抑制α-Syn寡聚体的胞间传递能够阻断LB的细胞间播散，从而减少神经元的损伤。

α-Syn寡聚体在神经元间传递过程中大量激活小胶质细胞。活化小胶质细胞爆发释放氧自由基及细胞因子，最终导致DA能神经元损伤[8-9]。其次α-Syn寡聚体在多巴胺神经元中的传递启动其自身凋亡程序，诱导多巴胺神经元的凋亡及坏死。因此，寻找α-Syn寡聚体多巴胺神经元间传递的相关信号通路，抑制α-Syn寡聚体神经元间的播散对于抑制PD的进展具有重要意义。

α-Syn寡聚体在神经元间传递与细胞吞噬功能密切相关。调节细胞吞噬功能的分子机制非常复杂，涉及胞内多条信号转导通路。其中Rho GTPase尤其Rac1、Cdc42和RhoA是关键的调控因子，其在活性型和失活型之间循环，参与调节细胞骨架蛋白的聚合、解聚及重组的动态循环启动并参与完成细胞吞噬全过程[10]。

本研究发现，α-Syn诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与Rho GTPases信号通路的活化相关。由此我们推测，Rho GTPases信号通路的活化促进了α-Syn诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡。调控Rho GTPases信号通路的活性可能成为PD治疗一个新的方向。

[1] Mollenhauer B, Forstl H, Deuschl G, et al. Lewy body and parkinsonian dementia: common, but often misdiagnosed conditions[J]. Deutsches Arzteblatt International, 2010,107(39): 684-691.

[2] Beraud D, Maguire-Zeiss KA. Misfolded alpha-synuclein and Toll-like receptors: therapeutic targets for Parkinson's disease[J]. Parkinsonism & Related Disorders, 2012,18(Suppl 1): S17-S20.

[3] Hosoi T, Ozawa K. Molecular approaches to the treatment, prophylaxis, and diagnosis of Alzheimer's disease: endoplasmic reticulum stress and immunological stress in pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2012, 118(3): 319-324.

[4] Mao Y, Finnemann SC. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires alphavbeta5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase[J]. Molecular Biology of the Cell, 2012,23(6): 1 104-1 114.

[5] Tourkova IL, Shurin GV, Wei S, et al. Small rho GTPases mediate tumor-induced inhibition of endocytic activity of dendritic cells[J]. J Immunol, 2007, 178(12): 7 787-7 793.

[6] Braak H, Del Tredici K, Rub U, et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease[J]. Neurobiology of Aging, 2003, 24(2): 197-211.

[7] Olanow CW, Brundin P. Parkinson's disease and alpha synuclein: is Parkinson's disease a prion-like disorder[J].Movement Disorders, 2013,28(1): 31-40.

[8] Depboylu C, Stricker S, Ghobril JP, et al. Brain-resident microglia predominate over infiltrating myeloid cells in activation, phagocytosis and interaction with T-lymphocytes in the MPTP mouse model of Parkinson disease[J]. Experimental Neurology, 2012, 238(2): 183-191.

[9] Kakita H, Aoyama M, Nagaya Y, et al. Diclofenac enhances proinflammatory cytokine-induced phagocytosis of cultured microglia via nitric oxide production[J]. Toxicology and Applied Pharmacology,2013,405(2):307-317.

[10] Tzircotis G, Braga VM, Caron E. RhoG is required for both Fcgamma R- and CR3-mediated phagocytosis[J]. Journal of Cell Science,2011,124(17):2 897-2 892.

(收稿2014-05-23)

Apoptosis induced by α-synuclein in SH-SY5Y cells associates closely with Rho GTPases signaling pathway activation

DingXuebing＊,WangXuejing,MaMingming,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhu450052,China

Objective To investigate the mechanism of the apoptosis induced by α-synuclein in SH-SY5Y cells. Methods SH-SY5Y cells apoptosis model induced by α-synuclein oligomers was established. Flow cytometry was performed to analyze the SH-SY5Y cell apoptosis. Immunofluorescence?stain was performed to detect α-synuclein-positive inclusions in SH-SY5Y cells. Pull down was performed to detect Rho GTPases signaling pathway activation in SH-SY5Y cells. Results Compared with the control group, the percentage of apoptotic cells,α-synuclein-positive inclusions and Rho GTPases signaling pathway in SH-SY5Y cells activity significantly increased in theα-synuclein oligomers group. Conclusion The apoptosis induced by α-synuclein oligomers in SH-SY5Y cells associate closely with Rho GTPases signaling pathway activation.

Rho GTPases signaling pathway; α-synuclein; SH-SY5Y cells; Apoptosis

国家自然科学基金项目(81301086，81100949)

R329.2+5

A

1673-5110(2014)23-0012-03