突变型TDP-43(A315T)蛋白诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制研究

吴守芳 江广予 马明明 丁雪冰 王雪晶

1)河南卢氏县人民医院 卢氏 472200 2)河南三门峡黄河医院 三门峡 452000 3)郑州大学帕金森病及相关运动障碍病病研究所 郑州 450052

突变型TDP-43(A315T)蛋白诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制研究

吴守芳1)江广予2)马明明3)丁雪冰3)王雪晶3)

1)河南卢氏县人民医院 卢氏 472200 2)河南三门峡黄河医院 三门峡 452000 3)郑州大学帕金森病及相关运动障碍病病研究所 郑州 450052

目的 探讨TDP-43(A315T)突变蛋白诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制。方法 采用真核细胞转染技术将Flag-TDP-43(wt)及Flag-TDP-43(A315T)质粒转入SH-SY5Y细胞，通过Western blot检测TDP-43截短型表达及自噬水平的变化；PI/Annexin-V-FITC检测细胞凋亡率；单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)染色检测细胞自噬空泡的变化。结果 与转染Flag-TDP-43(wt)组相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)细胞截短型片段Flag-TDP-35及Flag-TDP-25表达明显上调，下调细胞内源性Beclin 1水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低。与转染Flag-TDP-43(wt)组相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)诱导SH-SY5Y细胞自噬性小泡聚集明显减少。与转染Flag- TDP-43(wt)组相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)后SH-SY5Y细胞凋亡率增加。结论 TDP-43(A315T)突变蛋白可通过增加其截短型表达及抑制细胞巨自噬水平诱导SH-SY5Y细胞凋亡。

TDP-43(A315T)；SH-SY5Y细胞；自噬；凋亡

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和额颞叶变性 (frontotemporal lobar degeneration，FTLD)是两种临床少见的神经退行性疾病，研究证实，二者有共同的病理基础，即神经系统残存神经元及胶质细胞内存在泛素阳性包涵体，其发病与TDP-43基因突变导致神经元退行性改变相关[1]。TDP-43(TAR DNA-binding protein 43)是由 414 个氨基酸构成的一个多功能DNA和RNA结合蛋白，其在RNA转录、选择性剪接及mRNA稳定性调节等过程中发挥功能[2]。家族性ALS病例中，也已鉴定出40多种TDP-43蛋白突变[3]，越来越多的研究证实，TDP-43蛋白与ALS及FTD的发病密切相关，但其表达的蛋白在发病中机制如何至今尚不能确定。本课题组在1例ALS家系中筛选到TDP-43基因A315T突变。以往研究显示，携带此突变的患者中枢神经系统内TDP-43发生片段化，产生大量TDP-43截短型片段，失去了正常的胞核定位，在胞核及胞浆中大量聚集形成包涵体[4]。但TDP-43(A315T)突变蛋白的具体致病机制，至今仍未明确。

1 材料与方法

1.1 材料 Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)质粒由上海吉凯有限公司构建合成。SH-SY5Y细胞由湘雅医院唐北沙教授惠赠。转染试剂脂质体Lipofectamine TM 2000购于美国Invitrogen公司，DMEM培养基、OPTI-MEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司，抗TDP-43抗体购自Abcam美国公司、抗Beclin-1 抗体购自Eptimics美国公司、LC3抗体购自Abcam公司、GAPDH抗体购自美国 Santa Cruz Biotechnology公司、过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自美国Promega公司、MDC购自Sigma公司。

1.2 质粒转 SH-SY5Y细胞常规培养于15% FBS的DMEM完全培养液中。待细胞铺满培养瓶底35%～45%后，弃去DMEM，每孔加入2 mL OPTI-MEM，将2～4 μL的质粒及1.0 μL lipofectamine TM 2000分别与100 μL OPTI-MEM混匀后，共同加入六孔板的每个孔中，混匀，在37℃、5% CO2的培养箱中孵育6 h，改用含10% FBS的DMEM培养基继续孵育48 h。

1.3 免疫印迹检测细胞TDP-35、TDP-25、Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值 SH-SY5Y细胞细胞分别转染Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)48 h后，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白样本转移至硝酸纤维滤膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗3次，加入抗TDP-43(1∶500)、抗Beclin 1(1∶800)、抗LC3(1∶500)抗体，4℃过夜。加入过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶5000)，置于水平脱色摇床上孵育1 h，TBST漂洗5次，ECL光化学法显色。凝胶成像分析系统分析扫描。

1.4 MDC检测细胞自噬空泡变化 SH-SY5Y细胞细胞分别转染Flag-N1、Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)24 h后，以4%多聚甲醛，4℃下固定10 min，PBS洗3遍，加入终浓度为50 μmol/L的MDC染色液，37℃下孵育60 min，PBS洗3遍，荧光显微镜下观察细胞自噬空泡的变化。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 SH-SY5Y细胞分别转染Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)24 h后，取200 μL细胞悬液加入10 μL Annexin-/FITC和20 μg/mL PI溶液20 μL，混匀后室温避光孵育30 min，加入800 μL 1×PBS，以流式细胞仪PI/Annexin-V-FITC检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 Western blot检测细胞内源性TDP-35蛋白、TDP-25蛋白、Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达 在SH-SY5Y细胞内过表达Flag、Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)，Western blot结果显示，与Flag相比，过表达Flag-TDP-43(WT)，使SH-SY5Y细胞中Beclin 1表达上调且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增高；与Flag-TDP-43(WT)相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)使SH-SY5Y细胞中Beclin1表达明显下调且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低。过表达Flag-TDP-43(A315T)使SH-SY5Y细胞中TDP-35及TDP-25表达上调。见图1。

图1 Western blot检测SH-SY5Y细胞内源性TDP-35蛋白、TDP-25蛋白、Becline 1蛋白及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表达

2.2 MDC染色检测SH-SY5Y细胞细胞中自噬空泡的变化 在SH-SY5Y细胞内过表达Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)，MDC染色结果显示，与Flag-TDP-43(WT)相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)导致MDC染色信号减弱，自噬空泡聚集减少。见图2。

图2 MDC染色检测SH-SY5Y细胞细胞中自噬空泡的变化(免疫荧光×400)

2.3 PI/Annexin-V-FITC检测TDP-43(A315T)对细胞凋亡率的影响 PI/Annexin-V-FITC检测细胞凋亡率，结果显示，与Flag-TDP-43(WT)相比，过表达Flag-TDP-43(A315T)使细胞凋亡率上调。见图3。

图3 PI/Annexin-V-FITC检测细胞凋亡率的变化

3 讨论

生理状态下，TDP-43蛋白在细胞胞浆内合成后转变为稳定的多肽，成熟的TDP-43蛋白大部分转运至核内，与TAR DNA 结合，发挥调节转录并参与 mRNA 修饰的功能；而留在胞浆中的TDP-43及TDP-43经caspase-3 切割产生的C-末端片段(C-terminal fragments，CTFs)含量甚微。ALS及FTLD患者中枢神经系统内TDP-43发生片段化，产生大量TDP-43 CTFs，失去正常的胞核定位，在胞核及胞浆中大量聚集形成包涵体，包涵体内残存的TDP-43被过度磷酸化修饰。2011年吴瑛教授研究证实TDP-43野生型和A315突变型蛋白在生物化学及结构方面有差异，TDP-43(A315T)突变蛋白可产生截短型毒性片段在细胞间横向播散而致病[5]。但TDP-43的毒性截短型片段导致细胞损害的具体机制至今仍未明。

自噬(autophagy)是真核细胞所特有的一种重要的高度保守的防御和保护机制，是细胞亚细胞膜结构发生动态的形态改变，并通过细胞溶酶体介导自身的大分子物质或受损的细胞器的吞噬降解过程，对维持细胞生理平衡以及机体内环境的稳定起到重要作用[6]。越来越多的研究表明，自噬功能的失调在ALS的发病机制及发展过程中起到重要作用。自噬是细胞内的大分子营养物质和细胞器在溶酶体内降解的过程。自噬过程可分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。在巨自噬形成过程中，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增高。Beclin 1通过与Vps34结合激活P13K通过促进自噬体的形成，能够反映体内巨自噬的激活水平。细胞内环境紊乱时，细胞自噬被抑制，导致蛋白降解障碍，在细胞内聚集而致病。

本研究发现，TDP-43(A315T)转染细胞后产生大量毒性截短型片段，通过下调SH-SY5Y细胞中Beclin 1 蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，抑制自噬水平，促进细胞凋亡。由此我们认为，TDP-43(A315T) 通过抑制SH-SY5Y细胞自噬诱导神经元细胞凋亡；调控自噬可能作为ALS治疗一个新的方向。

[1] Sephton CF, Cenik B, Cenik BK, et al.TDP-43 in central nervous system development and function: clues to TDP-43-associated neurodegeneration[J]. Biological chemistry, 2012, 393(7): 589-594.

[2] Kanouchi T, Ohkubo T, Yokota T. Can regional spreading of amyotrophic lateral sclerosis motor symptoms be explained by prion-like propagation[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2012, 83(7): 739-745.

[3] Kanouchi T, Sekiguchi T, Mizusawa H, et al. Whether or not ALS lesions spread contiguously[J]. Rinsho Shinkeigaku, 2012, 52(11):1 059-1 061.

[4] Polymenidou M, Cleveland DW. The seeds of neurodegeneration: prion-like spreading in ALS [J]. Cell, 2011, 147(3): 498-508.

[5] King OD, Gitler AD, Shorter J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease [J]. Brain Res, 2012, 1462: 61-80.

[6] Johnson BS, Snead D, Lee JJ, et al. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity [J]. The Journal of biological chemistry, 2009, 284(30):20 329-20 339.

(收稿2014-05-25)

Mutant TDP-43(A315T) induced SH-SY5Y cells apoptosis by regulate autophagy

WuShoufang＊,JiangGuangyu

＊DepartmentofNeurology,LushiPeople'sHospital,Lushi472200,China

Objective To investigate the mechanism of the TDP-43(A315T) regulate autophagy and induced apoptosis mechanism in SH-SY5Y cells. Methods The recombinant plasmid Flag-TDP-43(wt) and Flag-TDP-43(A315T) were transfected into SH-SY5Y cells transfection technique. The cells were collected 24h later, and the cell total protein were extracted to detect Beclin 1, LC3Ⅱ and LC3Ⅰprotein expressions by Western blot. The autophagic vacuoles in the cells were stained with MDC, the cell apoptotic ratio was determined with PI/Annexin V-FITC staining by flow cytometry analysis. Results Compared with the control group transfected Flag-TDP-43(wt), in the group of overexpression Flag-TDP-43(A315T), the level of Beclin 1 protein expression was decreased, and also to the level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ. The percentage of apoptotic cells increased in the Flag-TDP-43(A315T) group. Conclusion TDP-43 (A315T) induced apoptosis of SH-SY5Y cells by up-regulation autophagy.

TDP-43(A315T); SH-SY5Y; Autophagy; Apoptosis

国家自然科学基金项目(81100949)

R329.2+5

A

1673-5110(2014)23-0026-03