RECK基因甲基化与喉鳞状细胞癌预后的关系

崔 静，李 辉，田艳勋

0 引 言

喉癌在人恶性肿瘤中占比不足2%，其发病率具有较大的区域性差异，好发于60～70岁的男性，其病因尚不完全明确［1］。有研究报道，过量的吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒感染等均可增大患喉癌的风险性［2］。从病理学角度看，大多数喉癌是鳞状细胞癌。尽管近年来外科手术，放疗、化疗方案等均取得较大进步，但喉鳞状细胞癌患者的5年生存率并未明显改善，可能与其多阶段、多病灶等生物学特性有关［3］。同时，喉鳞状细胞癌具有较大的继发消化系统、呼吸系统等恶性肿瘤的危险，积极探索其继发其他癌变的早期生物学标志，对恶性肿瘤的防治具有重要意义。RECK基因是一种新型抑癌基因，具有抑制肿瘤细胞再生、浸润和转移的作用［4］。近年来，有研究表明，RECK基因表达下降与启动子区的甲基化有关，但其在喉鳞状细胞癌中的作用目前尚不清楚，DNA的异常甲基化是恶性肿瘤的早期事件，并可作为某些肿瘤诊断和预后的生物标志［5］。本研究检测了原发性喉鳞状细胞癌和癌旁组织RECK基因的甲基化状态，分析RECK基因启动子区的甲基化是否与预后存在某种关联，旨在为探索喉鳞状细胞癌变的早期事件，为其预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院2006年7月至2007年12月经外科手术切除的喉鳞状细胞癌标本70份，标本均经石蜡包埋。所有标本均经手术切除并经病理学检查明确诊断，并排除合并其他恶性肿瘤者及术前接受过化疗、放疗等抗肿瘤治疗者。

同时收集上述患者由于治疗需要而切除的癌旁组织标本(长度＞10 mm)29例，均经过临床及组织病理学检查排除恶性肿瘤。标记好标本号、年龄、性别等主要信息与喉临床细胞癌标本进行匹配。以正常体检的15名健康者的喉黏膜标本为对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器 蛋白酶K(北京艾比根生物技术有限公司);Tris.Base(上海拜沃生物科技有限公司);Wizard DNA Clean-Up System(Promega公司);Tap酶(Invitrogen，USA);甲基化转移酶(M.SssI)(NEB公司，美国);引物、三氯甲烷、饱和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、无水乙醇(大连宝生生物公司)。

恒温水浴箱(SHELLAB公司，美国);高速离心机(Eppendorf公司);Gene Amp 9700型PCR扩增仪(ABI公司，美国);凝胶自动成像仪(TOCAN 320型);电泳仪(伯乐公司，美国)。

1.2.2 DNA提取 采用标准蛋白酶K消化法进行DNA提取，在提取之前，组织标本经HE染色证实肿瘤细胞的存在，并选择恶性肿瘤细胞≥75%的区域的组织提取DNA。

1.2.3 亚硫酸氢钠修饰 参照《分子克隆实验指南》进行操作［6］:先将约 2 μg DNA 在 1.5 mL EP 管中，用双蒸水稀释至50 μL，加 5.5 μL 新鲜配制的3 mol NaOH后 42℃ 水浴 30 min，然后加 30 μL 10 mmol/L对苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520 μL 3.6 mol亚硫酸氢钠(配制:1.88 g 亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3 mol/L NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5 mL)。EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液，加200 μL石蜡油，50℃避光水浴16 h。

1.2.4 修饰后的DNA纯化回收 预热树脂10 min(37℃)，将移液器枪头伸入石蜡油层下吸取混合液600 μL至一洁净2 mL EP管中;然后使用 Promega wizard Clean up DNA纯化回收系统，对修饰后的DNA进行纯化回收。

1.2.5 甲基化特异性PCR反应 PCR反应体系:去离子水 11.65 μL;10 × buffer 2 μL;dNTP 1.6 μL;上、下游引物各 1 μL;DNA 模板 3 μL;Tap 酶 0.15 μL;加去离子水至 20 μL。

循环参数:94℃预变性5 min后35个循环:94℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸30 s，最后1个循环延伸5 min。

将产物琼脂糖凝胶(2.5 g/L)电泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶处理正常人外周血细胞、去离子水分别作为甲基化阳性对照、甲基化阴性对照及空白对照。每批标本同时扩增甲基化和非甲基化阳性对照。

甲基化上游引物:5'-GTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTCGA-3'，下 游 引 物:5'-TCCAAAACCTCCCGAAAACGAAAACG-3';非甲基化上游引物:5'-GGTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3'，下游引物:5'-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3'。

1.3 统计学分析 所有数据均采用SPSS 20.0软件进行处理，RECK基因启动子区甲基化状况与临床病理参数的关系采用χ2检验，必要时采用Fisher确切概率法。对完成至少5年随访的患者行生存分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法估计，并采用Log-rank检验分析不同组别的差异。危险因素与患者总体生存率的关系采用多因素COX比例风险模型分析，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床及病理学特征 70例患者中，共有37例(52.86%)发生 RECK基因甲基化，经 χ2检验，RECK基因甲基化在不同年龄、性别，吸烟、饮酒、淋巴结转移与否，TNM分期间差异无统计学意义(P＞0.05);肿瘤组织中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率远远高于分化程度较低的患者。15名正常人喉黏膜组织均未发现甲基化。见表1。

2.2 喉鳞状细胞癌及正常组织的甲基化情况 37例(52.86%)原发喉鳞状细胞癌标本发生甲基化，见图1。29对喉鳞状细胞癌-癌旁组织匹配的标本中，喉鳞状细胞癌组织发生RECK基因甲基化16例(55.12%)，癌旁组织发生RECK基因甲基化8例(27.59%)，经配对四格表资料的精确概率检验，2组的甲基化率比较差异有统计学意义(P=0.029)。见表2。

2.3 RECK基因启动子区甲基化与患者的生存预后的关系 本组70例患者中，64例完成了5年随访，中位无瘤生存期为41个月，中位总体生存期为52个月。本研究只针对完成5年随访的64例患者分析RECK基因启动子区甲基化与生存预后的关系。经Log-rank分析，RECK基因甲基化可明显缩短患者的无瘤生存期和总体生存期(P=0.017，P=0.024)，见图2。此外，有淋巴结转移、Ⅲ-Ⅳ级临床分期、肿瘤组织中等及高分化与患者较差的预后有关，有淋巴结转移、Ⅲ-Ⅳ级临床分期可明显缩短患者的无瘤生存期和总体生存期。肿瘤组织中等及高分化可缩短患者的无瘤生存期。见表3。

行多因素COX回归(ENTER)分析，无瘤生存期及总体生存期的COX回归方程拟合效果均较好(χ2=12.374，P ＜0.001;χ2=24.123，P=0.001)，结果显示:RECK基因甲基化是患者无瘤生存期的独立危险因素;总体生存期的独立危险因素为:有无淋巴结转移、临床分期、RECK基因甲基化，提示:RECK基因甲基化与喉鳞状细胞癌患者的生存期具有重要的关系。见表3、表4。

表1 喉鳞状细胞癌标本不同病理参数间RECK甲基化情况比较(n=70)Table1 The status of RECK methylation in different pathological parameters(n=70)

图1 部分组织甲基化特异性PCR电泳图Figure1 Part of electrophoresis of methylation specific PCR

表2 29对经匹配的喉鳞状细胞癌及正常喉组织标本甲基化率比较Table2 The comparison of methylation rate in 29 matched pairs of samples

图2 64例完成5年随访者的无瘤及总体Kaplan-Meier生存曲线Figure2 Cancer-free and overall Kaplan-Meier survival curves of 64 patients completed the 5-year follow-up

表3 不同临床病理参数之间的无瘤生存期及总体生存期Log-rank检验结果(n=64)Table3 Results of Log-rank test of cancer-free survival and overall survival between different clinicopathological parameters(n=64)

表4 多因素COX回归分析喉癌患者预后的影响因素(n=64)Table4 The multivariate COX regression for factors influenced the prognosis of patients with laryngeal cancer(n=64)

3 讨 论

RECK基因启动子区的甲基化与许多恶性肿瘤的转移和浸润有关。本研究结果显示:RECK基因甲基化不仅在喉鳞状细胞癌组织中发生，而且在喉鳞状细胞癌旁正常组织中也会发生，并且在15名健康者正常组织中均未见RECK基因甲基化，说明抑癌基因甲基化可作为恶性肿瘤早期发生的生物学标志。本研究实验结果还发现29对喉鳞状细胞癌组织-癌旁组织匹配的标本中，有3例仅在癌旁组织中发生了甲基化，而相对应的喉鳞状细胞癌组织中未发现RECK甲基化，提示病理学正常的组织发生RECK基因甲基化可能预示着恶性肿瘤附近的组织具有一个范围较大的潜在的甲基化区域，在肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤中也发现了类似的规律，因此，抑癌基因启动子区甲基化可看做是恶性肿瘤的一类癌前病变［7］。

RECK基因一种新型抑癌基因，定位于9P13-9P12，通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)而实现抑制肿瘤细胞再生、浸润和转移的作用［8－9］。有实验结果表明:在恶性肿瘤组织中，MMP2、MMP9均呈高表达，特别是MMP2的阳性表达与肿瘤分期、淋巴结状态等病理特征具有重要关系［10－11］。有研究提示，RECK基因高表达的肿瘤患者的生存预后明显优于RECK基因低表达者［12］。这与本实验结果综合提示:喉鳞状细胞癌RECK基因由于甲基化而灭活，从而使患者的生存预后更差［11，13］。因此，去甲基化可应用于抗肿瘤的治疗过程中，可为改善包括喉鳞状细胞癌在内的恶性肿瘤患者的治疗带来新希望［15］。

以往有研究表明:吸烟、饮酒是影响恶性肿瘤患者生存的危险因素，这一规律也得到了很多学者的认同［16］。但本研究发现吸烟、饮酒与患者的生存率关联不大，但这并不意味着吸烟、饮酒不是喉鳞状细胞癌患者生存率的影响因素。喉癌的早期症状为声音嘶哑、有异物感、痰多、咽部不适等，这些症状的存在，可能会使患者减少吸烟、饮酒，从而减弱了其与喉鳞状细胞癌的真实关联。因此，吸烟、饮酒仍然是影响喉鳞状细胞癌患者生存的潜在危险因素，并具有重要的公共卫生学意义。

本研究重点分析了RECK基因启动子甲基化状况与预后的关系。结果表明:甲基化的RECK基因检测是预测患者较差预后的新途径，越来越多的研究结果支持这一观点［12－13］。

RECK基因启动子区甲基化是人喉鳞状细胞癌的早期事件，在癌旁正常组织中也可发生，并且与患者较差的预后有重要关联。RECK基因启动子区甲基化可作为一个重要的早期发现并预测患者预后的早期生物标志物。

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