叉头框转录因子M1对人结肠癌细胞恶性表型的影响

冒晓蓓，刘小北，徐 凯，褚晓源，郁红菊，薛利军，陈亚楠，任丽丽，戴婷婷，陈龙邦

0 引 言

近年来结肠癌在我国呈现高发病趋势，是全球三大最常见的癌症之一［1］。目前采用手术和放化疗都可使结肠癌病情得到显著改善，但晚期结肠癌患者预后仍然较差，尤其是肝转移极易发生［2］。叉头框转录因子M1(Forkhead box M1，FoxM1)是Fox转录因子家族的重要成员之一，在维持细胞增殖与凋亡的动态平衡中发挥着重要的作用［3］。FoxM1基因表达激活使细胞分化受到抑制，从而导致了分化不良细胞的恶性转变［4］。多个研究发现FoxM1基因在肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中高度表达，且其表达水平与肿瘤的分级、分期和预后有着显著性的相关性［5－8］。初步研究显示，FoxM1在肠癌中异常高表达［9］，对肿瘤的生长、侵袭以及血管的生成能力均有着重要的影响。前期研究显示FoxM1参与了大鼠结肠癌的发生和增殖［10］。为了解结肠癌细胞基因调控的分子机制，我们进一步探讨了FoxM1对人结肠癌细胞的侵袭和转移的影响，为开发新的结肠癌靶向治疗方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 肠癌细胞系HT-29、HCT-116均为本课题组保存。其中HT-29细胞培养采用RPMI 1640培养液(美国Hyclone公司)、HCT-116细胞培养采用DMEM培养液(美国Hyclone公司)，均添加10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)及1%双抗(南京凯基生物技术发展有限公司)，在含5%的CO2的37℃培养箱中继代培养。细胞均为贴壁生长，每隔2天更换培养液1次，根据细胞生长状况按1∶2～1∶4传代，消化细胞所用2.5%胰酶购自南京凯基生物技术发展有限公司，待细胞融合至70%～80%，可进行后续试验。

1.2 FoxM1的超表达载体及siRNA干扰载体的构建 对FoxM1基因设计3条siRNA干扰序列:5'-GCUGGGAUCAAGAUUAUUATT-3'、5'-GUGGGCCCAACAAAUUCAUTT-3'、5'-GGCUGCACUAUCAACAAUATT-3'，应用RT-PCR及Westen bolt方法检测 HT-29细胞株中FoxM1的干扰效率，筛选出抑制效果最佳的序列:5'-GGCUGCACUAUCAACAAUATT-3'。相应的干扰质粒载体pGPH-shFoxM1及相应的空载体质粒对照(pGPH-shNC)，过表达FoxM1基因的质粒载体(pEX-2-FoxM1)及相应的空载质粒(pEX-2-NC)，均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.3 细胞转染体系建立及实验分组 HT-29和HCT-116细胞株转染方法按Lipofectamine 2000产品说明书进行。转染前1d将细胞分别以1×105个/孔、5×104个/孔的密度接种于24孔板中，使转染前细胞融合率达到60%～70%。转染时设定脂质体的浓度分别为 0.5、1、1.5 μL，并将其稀释于RPMI 1640或DMEM培养基50μL，pGPH-shFoxM1及其阴性对照pGPH-shNC 的浓度分别为:0.5、1、2、4μg，稀释后脂质体静置5 min，与同样用培养基50 μL稀释的质粒混合，静置20 min，分别加入24孔板中。转染6 h后更换新鲜培养液继续培养，48～72 h后荧光显微镜观察转染效率。HCT-116、HT-29 2种细胞株均分为3组，具体如下述:①空白对照组(不转染组);②实验对照组:转染相应空载质粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);③实验组:转染FoxM1干扰质粒及FoxM1过表达质粒。

1.4 荧光实时定量(real time PCR，RT-PCR)法检测FoxM1基因表达水平 取各组转染后24 h细胞，采用Trizol提取总RNA，经Dnase酶消化基因组DNA后，采用TAKARA公司的反转录试剂盒(Prime-Script1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行cDNA的反转录，方法参照试剂盒说明书。同时采用TAKARA公司的定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)进行RT-PCR检测，反应体系参考试剂盒说明书。PCR反应条件为95℃，10s;60℃，10s;72℃，10s;共40个循环。读取CT值，采用△△CT法进行数据分析。

FoxM1的定量引物为:正义链:5'-AACCGCTACTTGACATTGG-3'，反义链:5'-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3'。GAPDH的定量引物为:正义链:5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3'，反义链:5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。

1.5 Western blot方法检测FoxM1蛋白表达水平提取转染72 h后各组细胞的总蛋白，并进行蛋白定量，按《分子克隆实验指南》［11］所述方法配制SDSPAGE分离胶(12%)和浓缩胶(5%)，待胶凝固后每孔上样30 μg蛋白，常规电泳、转PVDF膜、显像。利用图像分析仪对胶片显像条带进行灰度分析，以内参照β-actin进行校正。

1.6 划痕愈合试验 取对数生长期稳定的转染细胞，细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板，置37℃细胞培养箱中孵育过夜后回收CollagenⅣ，再将培养板在培养箱中干燥过夜，培养至细胞呈现出单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕，用含10%FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0、12、24、48h每个孔取4个视野拍照，在倒置显微镜下观察划痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。

愈合率(%)=(0 h划痕宽度－24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%

1.7 Transwell侵袭试验 取对数生长期稳定转染细胞，用无血清RPMll640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性。结果表示为穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数，显微镜下每个复孔取5个高倍镜视野计数(×400)，计算平均值。1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。定量结果以均数±标准差(±s)表示，两组间均值比较采用t检验，多组之间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2株人肠癌细胞系的 FoxM1表达分析RT-PCR及Western blot检测均显示，FoxM1在HT-29细胞中表达水平较HCT-116高。见图1。

图1 HCT-116及HT-29细胞株中mRNA及蛋白表达比较Figure1 Expression of FoxM1 mRNA and protein in HCT-116 and HT-29 cell lines

2.2 HT-29和HCT-116转染体系的建立 采用pGPH-shNC(FAM)空载体转染HT-29和HCT-116细胞48 h后检测荧光信号，根据荧光强度检测转染效率，从而建立高效的HT-29和HCT-116转染体系。结果表明，脂质体为 1 μL/孔 ，pGPH-shNC(FAM)浓度2 μg/孔时，共培养48 h为最佳的转染条件。见图2。

图2 pGPH-shNC(FAM)载体转染HT-29细胞48 h后荧光信号表达Figure2 Fluoresecent signals in HT29 cells transfected by pGPH-shNC(FAM)vector post 48 hours

2.3 FoxM1基因对HT-29和HCT-116侵袭性的影响 为研究FoxM1的表达对人结肠癌细胞的调控，本研究基于优化的HT-29和HCT-116转染体系，应用RNA干扰技术有效下调FoxM1在HT-29细胞中的表达，同时采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达水平，24h后提取RNA，72 h后提取蛋白。RT-PCR检测结果表明HCT-116细胞株中过表达FoxM1后其mRNA的表达水平显著上调，采用pGPH-shFoxM1转染HT-29细胞后，FoxM1表达水平显著下调。Western blot结果亦表明，FoxM1蛋白在HT-29中成功下调，在HCT-116中成功上调。见图3。

图3 FoxM1在HCT-116及HT-29细胞转染pGPH-shFoxM1和pEX-2-FoxM1的表达变化Figure3 FoxM1 expression in HCT-116 and HT29 cell lines transfected by pGPH-shFoxM1 and pEX-2-FoxM

2.3.1 划痕愈合实验 转染 pGPH-shFoxM1 48 h后，HT-29的增殖能力明显受到抑制，愈合率仅为(10.37±3.86)%，与 HT-29实验对照组(42.0±2.0)% 及 HT-29空 白 对 照 组(37.0±2.2)%相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。而在HCT-116细胞中上调表达FOXM1后，愈合率提高至(70.92±1.48)%，表示增殖力明显得到了提高，与HCT-116实验对照组［(18.43±3.01)%］及 HCT-116空白对照组［(67.36±2.61)%］相比差异具有统计学意义(P ＜0.05)。见图4。

2.3.2 Tanswell小室检测细胞侵袭能力 HT-29和 HCT-116肠癌细胞接种在 Matrigel胶铺被的 transwell小室中48 h之后，HCT-116实验组平均穿膜细胞数［(186.0±6.8)个］较HCT-116实验对照组［(42.0±2.0)个］和HCT-116空白对照组［(37.0±2.2)个］升高，差异有统计学意义(P＜0.05);HT-29实验组平均穿膜细胞数［(53.0±1.8)个］较 HT-29空白对照组［(118.0±4.0)个］和 HT-29实验对照组［(95.0±2.2)个］降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图5。

图5 FoxM1对HCT-116及HT-29细胞侵袭的影响Figure5 The effect of FoxM1 on the invasion of HCT-116 and HT-29

图4 FoxM1对HCT-116及HT29细胞迁移的影响Figure4 The effect of FoxM1 on the migration of HCT-116 and HT29

3 讨 论

FoxM1参与细胞增殖、凋亡以及人体多种器官发育［4］。FoxM1仅表达于高增殖状态的细胞中，如所有胚胎组织，特别是上皮和间质的增殖细胞中;在人体组织中，FoxM1仅高度表达于胸腺和睾丸组织，中度表达于肺和肠道［12］。恶性肿瘤的发生正是由于在致癌因素作用下，遗传物质发生改变导致细胞增殖信号过度活化。研究发现，FoxM1常高表达于肝癌［13］、前列腺癌［14］、胃癌［15］等多种恶性肿瘤中，同时，它与多种癌基因信号转导途径相关［16］，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路、核转录因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路、细胞外信号激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路、蛋白酶体通路等。特异性FoxM1抑制剂在肿瘤治疗方面的研究提示FoxM1极有希望成为一个新的抗癌靶点［17］。

在肝细胞癌(hepatic celluler cancer，HCC)中，FoxM1是ERK的主要效应器。FoxM1b在HCC小鼠模型及HCC细胞系中，均有高表达。其表达增高与ERK正相关，可促进HCC的肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表达，可下调ERK激活水平，减少HCC细胞株的血管形成，促进细胞凋亡［18］。FoxM1c可增强细胞增殖的关键因子cyclin E/Cdk2的表达，后者被认为是c-myc基因的反式激活启动子［4］。有学者在胃癌细胞株研究中发现，c-myc是FoxM1调控的下游基因［15］。国内外研究发现，FoxM1和NF-κB在细胞分化、细胞周期、细胞增殖、细胞死亡、细胞迁移等生物学行为中发挥重要作用［19－20］，但两者之间的相互作用机制仍需进一步阐明。Ma等［21］发现，Raf/MEK/MAPK的激活对于FoxM1核转移不可或缺，同时，可促进FoxM1与cyclin B1之间交互作用，继而促进细胞的有丝分裂。应用Raf/MEK/MAPK抑制剂U0126后，FoxM1表达显著受抑，并使细胞停滞于G2/M期。综上所述，FoxM1表达失调与多种细胞增殖、凋亡等进程相关细胞因子及信号转导通路均相关，已成为研究肿瘤发生、发展过程中的新热点分子。

本研究在细胞水平探索了FoxM1表达水平变化对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性。首先针对FoxM1基因设计了3条不同的 siRNA干涉序列，优化siRNA转染条件后应用不同的siRNA对细胞进行转染，最终选定抑制效果最强的FoxM1 siRNA。继而根据该序列合成干扰表达质粒pGPH-shFoxM1。应用 RT-PCR及 Western blot检测，提示FoxM1在HT-29细胞中高表达，而在HCT-116细胞中呈低表达。进一步在细胞水平探索了FoxM1表达对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性的影响。采用RNA干扰的方法下调结肠癌细胞HT-29中FoxM1表达水平并采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达，利用划痕实验和细胞侵袭实验探讨FoxM1对结肠癌细胞生长和侵袭能力的影响。结果显示RNA干扰可使FoxM1表达下调，下调FoxM1表达可抑制细胞的迁移能力和侵袭性。反之，过表达质粒可有效调高FoxM1表达水平，上调FoxM1表达可提高细胞的迁移能力和侵袭性。本研究与Kalinichenko等［6］研究结果相似，抑制FoxM1表达可显著抑制肝癌等多种细胞的迁移能力和增殖性。这些结果均为寻找新的治疗靶点提供了有力的依据。总之，FoxM1对结肠癌细胞增殖和侵袭能力具有重要的影响，具有发展成新型结肠癌治疗靶位的潜力。

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