重组人血管内皮抑素联合紫杉醇对高侵袭性胃癌细胞增殖和侵袭作用的影响

耿海云，陈映霞，秦叔逵，杨爱珍，徐海军，成 远，薛 松

0 引 言

胃癌位于恶性肿瘤死因第3位［1］，目前其临床疗效仍不理想［2］。肿瘤生长通过新生血管从宿主获取营养成分，同时肿瘤细胞经血管发生远处转移，因此抗血管生成治疗成为胃癌分子靶向治疗的研究热点。重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin，rh-ES)(商品名恩度)是目前临床上应用较多的一种内源性血管生成抑制剂，通过多种作用机制抑制肿瘤生长［3］。本研究通过观察rh-ES联合紫杉醇在体外对高度侵袭型胃癌细胞株生物学活性的影响，了解其可能的作用机制，为进一步的临床研究和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人胃癌MGC803细胞株由我院中心实验室保存。紫杉醇注射液购自百时美施贵宝投资有限公司，rh-ES注射液购自山东先声麦得津生物制药有限公司。Transwell小室购自Croning公司，Matrigel购自BD公司;纤维粘连蛋白溶液(fibronectin，FN)购自Sigma公司;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9单克隆抗体、β-actin抗体以及HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自上海麦约尔生物技术有限公司。RIPA蛋白裂解液试剂盒购自碧云天公司，ECL反应检测试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒购自生兴生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 MGC803细胞株培养于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基中，置于37℃，5%CO2温箱中培养，每2～3天传代1次。根据实验设计将上述培养细胞分为:①对照组:加入与实验组等体积的RPMI 1640培养液;②紫杉醇组:加入浓度为0.0001 μg/mL 紫杉醇溶液;③rh-ES组:分别加 入 50 μg/mL rh-ES(rh-ES50 组)、100 μg/mL rh-ES(rh-ES100组)、200 μg/mL rh-ES(rh-ES200 组);④联合组:加入 0.000 1 μg/mL 紫杉醇 +50 μg/mL rh-ES(联合50组)、加入0.0001μg/mL紫杉醇+100 μg/mL rh-ES(联合 100 组)、加入0.000 1 μg/mL 紫杉醇 +200 μg/mL rh-ES(联合200组)。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖情况 取对数生长期的MGC803细胞，胰酶消化后计数，以每孔3×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，每组6复孔。加药后24、48、72 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸弃孔内培养基，加入盐酸异丙醇100 μL，微振荡器振荡10 min，用酶标仪在570 nm波长下测吸光度(A)值，各组取6孔平均值。计算细胞增殖抑制率:

抑制率=［1-(加药组平均A值-空白孔A值)/(对照组平均A值-空白孔A值)］×100%

采用药物相互作用指数(coefficient of drug interaction，CDI)反映rh-ES和紫杉醇两药相互作用性质。CDI值计算如下:

CDI=AB/A×B

AB=联合组A570/对照组A570

A、B=各单药组A570/对照组A570

如CDI＜0.9，表示两药作用性质为协同;CDI为0.9～1.1，两药性质为相加;CDI＞1.1，则两药作用性质为拮抗。

1.2.3 Transwell小室法测定细胞侵袭能力 将Transwell小室放入 24 孔板中，用 Matrigel 50 μL/孔均匀包被小室底部微孔滤膜的正面，10 mg/L的FN 50 μL均匀包被微孔滤膜的反面，每孔加入600 μL含30%胎牛血清的RPMI-1640培养液，收集对数生长期的MGC803细胞，用无血清的RPMI-1640培养液调整细胞密度为2×105个/mL，每小室加入50 μL细胞悬液。细胞分组后小室依次加入50 μL含对应药物浓度培养液，每组3复孔。置37℃、5%CO2温箱中培养24 h。取出小室，吸弃小室内的培养液，用棉签将膜上表面未迁移的细胞小心擦拭。下表面用10%甲醛固定30 min，苏木精染色20 min。显微镜下观察微孔滤膜外侧面上的细胞，计数6个视野内的细胞数，计算均值。

1.2.4 蛋白质印迹法检测细胞VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达 取对数生长期细胞加入蛋白裂解液，置于冰上裂解分离蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，根据标准曲线计算出蛋白浓度，调整各组上样蛋白量至50μg。灌制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶，加样后恒流40 mA，直至溴酚蓝到达分离胶底部。湿电转恒压100 V 90 min，将蛋白从凝胶转至PVDF膜，封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)封闭1h。封闭液按1∶4000和1∶1000的比例分别稀释一抗和β-actin抗体，4℃孵育过夜。用含0.05%Tween20的 TBST摇床洗涤3次(10 min/次)后，加入 1∶1000 二抗室温孵育 2 h，0.05%TBST溶液摇床洗膜3次(10 min/次)，ECL显影。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间各参数比较采用析因分析，多组间比较采用单因素方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同用药方式对MGC803细胞增殖能力的影响 与对照组相比，各用药组作用24、48、72 h后均能够减弱MGC803细胞的增殖能力，差异有统计学意义(P＜0.05)。联合组较紫杉醇组对细胞增殖抑制率明显增强。联合组中两药相互作用指数CDI值在0.91～1.01之间，说明两药对细胞的杀伤作用呈相加效应(P＜0.05)。在联合组和紫杉醇组中，细胞增殖抑制率具有剂量和时间依赖性，且各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。rh-ES组也观察到剂量依赖性，剂量越高，增殖能力减弱越明显，差异有统计学意义(P＜0.01)，但未呈现时间依赖性特征。见图1。

图1 不同药物作用后MGC803细胞的体外生长曲线Figure1 Growth curves of the MGC803 cells after treated with different drugs

2.2 不同用药方式对MGC803细胞侵袭能力的影响 与对照组相比，各用药组MGC803细胞的侵袭能力均受到抑制，差异有统计学意义(P＜0.01)。与紫杉醇比较，rh-ES100组和rh-ES200组细胞的侵袭能力减弱更为明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。各联合组MGC803细胞侵袭能力明显低于对应浓度rh-ES组(P＜0.01)，且联合组中细胞侵袭抑制率较紫杉醇组减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。不论是rh-ES还是联合组，随着rh-ES浓度的增加，对细胞侵袭抑制作用增强，且呈剂量依赖性，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 不同用药方式作用24 h后MGC803细胞的侵袭能力比较(±s)Tabel 1 Invasion ability of the MGC803 cells after treated with different drugs(±s)

表1 不同用药方式作用24 h后MGC803细胞的侵袭能力比较(±s)Tabel 1 Invasion ability of the MGC803 cells after treated with different drugs(±s)

与对照组比较，*P＜0.01;与紫杉醇组比较，#P＜0.05;与上一浓度组比较，△P＜0.01;与对应浓度rh-ES组比较，▲P＜0.01

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2.3 用药后 MGC803细胞 VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表达情况 胃癌MGC803细胞经不同用药方式作用后，VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量较对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。无论在rh-ES还是联合组中，随着rh-ES浓度增加，VEGF、MMP-2以及 MMP-9蛋白分别与β-actin蛋白的灰度值比值呈逐渐下降的趋势，提示VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白受到药物的抑制作用，表达量降低，且呈剂量依赖性。rh-ES100组和rh-ES200组VEGF以及MMP-2蛋白表达水平较紫杉醇组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，rh-ES50组与紫杉醇组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。rh-ES各组MMP-9蛋白表达水平较紫杉醇组差异无统计学意义(P＞0.05)。与紫杉醇组比较，联合组VEGF、MMP-2以及 MMP-9蛋白量相对较低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2，表2。

图2 不同药物作用后细胞VEGF，MMP-2以及MMP-9蛋白的表达Figure2 The VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein expression of the MGC803 cells after treated with different drugs

表2 药物作用后细胞VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白相对表达量的变化(±s)Tabel 2 Relative expression levels of the VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein after treated with different drugs(±s)

表2 药物作用后细胞VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白相对表达量的变化(±s)Tabel 2 Relative expression levels of the VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein after treated with different drugs(±s)

与对照组比较，*P＜0.01;与紫杉醇组比较，#P＜0.05;与上一浓度组比较，△P＜0.05;与对应浓度 rh-ES单药组比较，▲P ＜0.05

组 别 VEGF/β-actin MMP9/β-actin MMP2/β-actin对照组0.640 ±0.044 0.607 ±0.077 0.640±0.481紫杉醇组 0.528 ±0.018* 0.457 ±0.037* 0.543±0.021*rh-ES50 组 0.517 ±0.295* 0.489 ±0.013* 0.523±0.029*rh-ES100 组 0.455 ±0.044*#△ 0.425 ±0.250* 0.431±0.024*#△rh-ES200 组 0.395 ±0.197*#△ 0.418 ±0.034* 0.424±0.036*#联合50 组 0.420 ±0.374*#▲ 0.368 ±0.023*#▲ 0.379±0.027*#联合100 组 0.364 ±0.020*#▲ 0.297 ±0.015*#△▲ 0.364±0.016*#▲联合200组 0.306±0.033*#△▲ 0.241±0.032*#▲ 0.285±0.016*#△▲

3 讨 论

抗血管生成治疗成为抑制肿瘤生长新方法，目前应用于临床治疗的抗血管生成药物包括贝伐珠单抗、舒尼替尼、阿帕替尼、rh-ES等。目前晚期进展期胃癌的主要治疗手段是化疗，有效的化疗药物包括紫杉类、蒽环类、铂类、氟尿嘧啶等，细胞毒性药物的联合方案并未从根本上提高化疗的有效率，患者的中位生存期仍然很短［4］。40%～60%胃癌患者有VEGF表达，VEGF高表达者预后较阴性者差［5］，MMP-9高表达患者中位生存期(3.6个月)也较阴性者(10.5 个月)短(P ＜0.01)［6］，特别是未分化癌和印戒细胞癌患者的新生血管形成更加活跃［5］，因此胃癌的抗血管生成治疗成为了临床治疗的热点。

阿帕替尼是由我国研发的针对VEGF受体的口服小分子酪氨酸激酶抑制剂。Li等［7］报道了阿帕替尼850 mg/d组的无进展生存期和总生存期较安慰剂组显著延长。Ramucirmab是一种靶向VEGFR-2的全人源IgG1单克隆抗体，胃癌一线治疗后进展的患者经Ramucirmab单药治疗的中位总生存期和无进展生存期明显优于安慰剂组［8］。但是，抗血管形成通路拮抗在胃癌的治疗上显得举步维艰。特别是抗血管靶向治疗联合化疗至今未能被证实临床获益。舒尼替尼为多靶点的抗血管形成小分子酪氨酸激酶抑制剂，是晚期肾细胞癌抗血管形成治疗的重要药物。但在FOLFIRI和FOLFIRI联合舒尼替尼治疗胃癌的II期研究中［9］，发现增加舒尼替尼仅增加血液学毒性。贝伐珠单抗针对VEGF单靶点发挥作用，与化疗联合能够显著改善转移性结直肠癌患者的总生存期和无进展生存期;然而，胃癌患者未能从贝伐珠单抗联合化疗中获益［10］。推测其原因可能与胃癌侵袭转移方式更多，新生血管形成涉及更多的细胞因子和信号通路等有关;而抗血管形成多靶点TKI与化疗联合时毒性叠加、疗效相互拮抗。

rh-ES具有多靶点抗血管特征，通过作用血管内皮细胞，调节促血管形成因子、抗血管生长因子、MMP等因子的表达，发挥抗肿瘤抗转移作用，同时比贝伐珠单抗、阿柏西普以及舒尼替尼等不良反应低，与化疗联合并不增加其毒性，耐受性好。王金万等［11］报道rh-ES作用于非小细胞肺癌能够明显改善患者总的中位疾病进展时间、临床受益反应和有效率。对于血流丰富、以血行转移为主要转移途径的骨肉瘤，联合rh-ES可提高化疗对骨肉瘤的治疗疗效，且安全性较好［12］。陈建清等［13］报道 rh-ES 与化疗药物联合使用治疗肺癌以外的多种晚期难治性肿瘤具有良好的疗效。本课题组在前期的临床观察中发现，rh-ES联合化疗药物治疗晚期胃癌疗效明显，且不增加化疗毒性，安全性高［14］。

rh-ES联合紫杉醇可抑制MGC803的增殖能力，且作用具有相加效应。经不同浓度rh-ES处理后的MGC803穿过重建基底膜的能力明显降低，呈剂量依赖性，提示rh-ES联合化疗药物能显著降低胃癌细胞的侵袭转移能力。通过蛋白印迹法检测到用药组与对照组相比，VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表达明显下调，且随着rh-ES用药浓度的增加，各蛋白表达量下降越多，同时MGC803细胞的侵袭转移能力减弱越明显。推测rh-ES可能通过抑制MGC803细胞的VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表达，降低其侵袭能力，而胃癌患者的预后与VEGF、MMP-9的表达呈现明显的负相关［5-6，15-16］，推测 rh-ES 对上述血管形成通路关键因子的影响将对晚期胃癌的预后发生良性影响。

胃癌的转移途径包括淋巴道转移［17］、腹膜转移［18-21］、血行转移［22］等。本研究也发现 rh-ES 可明显减少胃癌细胞MMP-2以及MMP-9蛋白表达，提示内皮抑素联合化疗药物可通过多种机制抑制胃癌细胞的各种途径转移。目前，本课题组针对胃癌细胞侵袭、转移的其他机制如VEGF分子的亚类(VEGF-A、VEGF-C)、bFGF、TGF-β(转化生长因子)、整联蛋白等进行研究，深入了解紫杉醇联合rh-ES对高度侵袭性胃癌的作用机制。同时为了进一步证实紫杉醇联合rh-ES对胃癌的作用，还将开展动物体内实验，明确紫杉醇联合rh-ES抗胃癌转移的作用及机制，为后续临床研究提供依据。

总之，体外实验研究表明rh-ES联合紫杉醇能够有效抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力，其机制可能与其能够下调VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表达有关。下一步将深入开展体外和体内研究，进一步探讨rh-ES联合化疗药物抑制胃癌细胞侵袭转移能力及其可能的作用途径和机制，以证实rh-ES联合化疗对胃癌治疗的有效性，为开展临床研究提供理论支持。

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