三维联通纳米氧化锆多孔支架对犬骨髓间充质干细胞附着生长的实验研究

朱迎兰，朱瑞乔，史小蕾，董 震，金 磊

0 引 言

在骨组织工程领域，学者们尚未找到一种既拥有良好生物相容性又具备足够机械强度的仿生多孔支架。金属材料虽具强大的机械性能，但生物相容性差，存在细胞毒性、局部组织炎性反应等问题［1－2］。生物可降解陶瓷羟基磷灰石及 β-磷酸三钙被认为是理想的生物替代材料，但机械性能脆弱，仅用于那些非负重部位［3－4］，且如何保证其均匀降解、如何使骨组织的再生和支架的降解达到平衡仍然棘手。

氧化锆的机械性能优越，其压缩强度及三点弯曲强度可分别达到2000和900 MPa［5］。研究表明，氧化锆陶瓷对细胞、肌肉、口腔黏膜及骨组织无毒性作用［6］，并且较钛金属生物相容性更好、表面细菌黏附及增殖率更低［7］。作为表面涂层能够明显地增强钛合金的表面活性［8］，增强牙科种植体的骨结合作用［9］。因而我们希望利用氧化锆陶瓷优异的生物与机械性能来制备多孔支架。由于普通氧化锆陶瓷存在体内低温老化的特点，因此研究采用了粉体颗粒直径为纳米级的钇稳定氧化锆，该氧化锆经研究证明具有优异的低温抗老化能力。通过前期对纳米氧化锆粉体分散和模板成型工艺的研究，成功获得了微观形态结构与人松质骨相似的三维联通纳米氧化锆多孔支架［10］。本研究通过体外实验来评价其作为细胞载体供骨髓间充质干细胞(bone marrow stomal cells，BMSCs)附着及生长情况。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 钇稳定纳米氧化锆粉体(3YTZP，Tosoh，日本)，聚氨酯海绵模板(中国，佛山冠德);底面积 25 cm2透气培养瓶(Corning，美国)，DMEM低糖培养基(Hyclone，美国)，南美胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)，地塞米松(Sigma，美国)，β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)，抗坏血酸(Sigma，美国)，MTT(Gibco，美国)，ALP试剂盒(碧云天生物，中国)。

主要实验仪器有超声振荡机(VITASONICⅡ，Vita公司，德国)，高温烧结炉(KSL-1700X，合肥科晶，中国)，台式离心机(Centrifuge 0408-2，PeproTech公司，美国)，超净细胞培养工作台(SW-CJ-1D，苏州净化设备有限公司，中国)，CO2恒温培养箱(HF151，上海力申，中国)，倒置相差显微镜(CKX41SF，OlimPus公司，日本)，酶联免疫检测仪(Infinite f50，Tecan 公司，瑞士)。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米氧化锆支架的成型及表征 纳米氧化锆多孔支架的制备参照文献［10］。支架成型后，以扫描电镜观察其孔隙结构，浸泡介质法测定其开口孔隙率，万能实验机测定其压缩强度。

1.2.2 纳米氧化锆支架溶血实验 参照《中华人民共和国医药行业标准 YY/T 0127.1-93》［11］对研究制备的纳米氧化锆支架进行生物安全性评价，测定其溶血率。

溶血率=(试样的溶血吸光度值－阴性对照吸光度值)/(阳性对照吸光度值－阴性对照吸光度值)×100%

判断标准为:若材料的溶血率＜5%，则符合要求。

1.2.3 犬BMSCs的培养与诱导 抽取成年beagle犬(购于我院比较医学科，批准号0029943)髂前上棘骨髓10 mL置于25 cm2培养瓶中，全骨髓贴壁分离法分离、培养BMSCs，取第3代细胞用于实验。配制成骨诱导培养基，含10－8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 μg/mL 抗坏血酸，诱导干细胞向成骨细胞分化。碱性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)、茜素红染色鉴定其成骨功能。

1.2.4 细胞接种支架生长、分化检测 取第3代细胞，以1×106个/支架密度接种于多孔支架培养作为实验组，扫描电镜观察第2、7天细胞在支架上附着情况，MTT 法检测第1、3、6、9、12 天细胞在支架上增殖情况，PNPP 法检测第1、3、5、7、14 天细胞表达 ALP 水平。同样尺寸未接种细胞的纳米氧化锆多孔支架作为对照组。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计分析。定量结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Bonferroni校正方法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 支架结构表征 模板法成型的纳米氧化锆支架坯体、烧结成型后支架及其内部扫描电镜图见图1。支架完全复制了模板的外形，其内部结构表现为三维联通，其孔隙率测定值为(92.667±0.324)%。纳米级颗粒烧结后形成致密的孔茎结构，保证了支架的强度，其压缩强度值高达4.38 MPa。

2.2 支架溶血实验 实验表明，溶血率为2.19%，溶血率＜5%，符合生物材料安全标准，可用于生物实验。

图1 模板法成型的纳米氧化锆支架坯体、烧结成型后支架及扫描电镜图Figure1 Images of porous sponge foam and sintered ZrO2scaffold

2.3 犬BMSCs生长及功能鉴定 犬骨髓细胞分离后培养72 h首次换液，可见少量贴壁细胞，呈梭形、三角形，血细胞及单核细胞因不能贴壁或贴壁能力不同，经多次换液、传代而逐渐去除。随着培养时间的延长，细胞形态逐渐趋于一致，螺旋状生长，形成多个克隆单位，7～10 d可进行首次传代。传代后细胞增殖活跃，平均3～4 d可长满瓶壁的90%。经成骨诱导后，细胞形态由长梭形向多边形转化，见图2。第3代诱导细胞培养10 d行ALP染色、21 d行茜素红染色，结果均呈阳性。见图3。

图2 犬BMSCs诱导前后Figure2 Images of canine BMSCs before and after induction

图3 犬BMSCs诱导后ALP及茜素红染色结果Figure3 Osteogenic differentiation of cranine BMSCs in vitro

2.4 犬BMSCs附着纳米氧化锆多孔支架生长及成骨分化检测 细胞接种支架后第2、7天可见细胞能够在支架表面黏附、伸展、横跨支架孔隙向相邻孔壁爬行，见图4。MTT检测结果显示，与接种第1天比较(A 值0.261 ±0.034)，第3、6、9、12d 细胞在支架上增殖迅速(A 值分别为0.604 ±0.059，1.215 ±0.019，1.385 ±0.254，1.506 ±0.050)，差异有统计学意义(P＜0.01)。ALP表达水平检测结果示，犬BMSCs能在我们研制的纳米氧化锆多孔支架表面向成骨细胞分化，表达早期成骨标志。与实验组第1天比较(A值0.016 ±0.003)，第7、14 天细胞在支架上表达 ALP水平(A 值分别为0.032 ±0.002，0.062 ±0.007)显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图4 犬BMSCs附着支架生长扫描电镜结果Figure4 SEM images of canine BMSCs on ZrO2porous scaffold

3 讨 论

目前用于骨组织工程支架研究的材料主要分为生物衍生材料和人工合成材料两大类。生物衍生材料如珊瑚骨由于具有与天然骨相似的骨架结构，利于成骨细胞黏附生长，但其不易加工，机械强度不足［12］。人工合成材料致力于模拟天然骨形成机制，制备出仿生径向梯度分布、具生物活性且多孔的细胞支架材料，成为组织工程骨材料的研究热点。总的来讲，人工合成材料可分为有机高分子材料、无机生物陶瓷材料以及多种复合材料。聚酯类有机材料容易塑形，可降解性好［13］，然而其降解产物呈酸性，对微环境有影响，限制了其实际应用［14］。目前应用较多的骨替代品HA、磷酸三钙等无机生物陶瓷类材料，存在脆性较大，柔韧性不够，不易加工成型等不足［14］。

氧化锆陶瓷独特的应力诱导相变增韧机制使其具有较高的力学性能，稳定的化学性能使其具有很好的生物相容性，不仅可作为其他生物材料的增韧成分，还可单独作为生物材料应用于人体［5］。本研究选取纳米氧化锆陶瓷粉体为原料，采用聚氨酯模板法成功构建了三维联通多孔氧化锆支架。这种多孔的三维联通结构与人松质骨的结构形态相似，利于细胞生长过程中组织液的流通;该结构同时具有较大的内表面积和多孔性，可有利于成骨细胞的黏附，便于新生血管和骨组织的长入。溶血实验表明其符合生物材料安全标准。

人体骨松质为一种孔隙率在50%～90%的多孔结构，仿生骨组织工程支架孔隙结构的构建是必须的，足够的孔隙结构保证细胞生长过程中营养物质及代谢产物的流通，为细胞及血管化组织生长提供空间。本研究制备的纳米氧化锆多孔支架。较相同孔隙率条件下HA支架［15］显示出明显的机械性能优势，其强度符合体内应用要求。

骨髓间质干细胞具有多向分化潜能，在特定的条件下可向成骨、成软骨、成肌细胞及神经细胞等方向分化［16］。其中，BMSCs在添加地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的条件培养基中向成骨细胞样细胞分化，是一种较为成熟的获取成骨细胞的方法。研究中，我们成功地分离、培养犬BMSCs，并诱导其向成骨细胞分化。将细胞接种于支架后培养第2天，扫描电镜观察细胞附着及生长情况可见细胞在支架表面附着、伸展，并有新生细胞生长。培养7 d后，支架表面及孔隙内有大量细胞及其分泌基质分布，细胞伸出数个足突沿着孔隙壁逐渐向孔隙内爬行。运用MTT法对支架上细胞增殖情况进行动态监测发现，培养7 d内细胞数量迅速增多，但7 d后细胞增殖速度减慢，可认为大量细胞迅速增殖占据支架所有表面后随即出现细胞抑制现象，因而生长变缓。而此时，细胞开始进行其成骨功能表达，其ALP水平开始出现明显增高。由此拟定下一步的体内实验应在细胞接种7d以内进行，可将接种3～5d左右的支架植入体内以保证足够的细胞数量和最佳的细胞状态。

研究所得三维联通纳米氧化锆多孔支架具有明显优越的机械强度，良好的生物相容性，可以作为细胞载体，供BMSCs附着生长。

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