大豆蛋白中7S与11S组分的分离方法

张明成

（绥化学院 黑龙江绥化 152061）

一、前言

大豆中含有大量的贮存蛋白质，其含量可高达40%。根据沉降系数的不同，大豆蛋白可分为2 S、7 S、11 S和15 S四种组分，其中，7 S组分中的β-伴大豆球蛋白（β-c o n g l y c i n i n）和11 S组分中的大豆球蛋白（g l y c i n i n）是大豆分离蛋白的主要成分。由于7 S和11 S氨基酸的组成、亚基的结构及其相互作用不同，他们表现出的功能性质如乳化性、凝胶型等存在较大差异，与11 S球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白蛋白含有的巯基和二硫键较少，导致其凝胶保水性和黏结性较差，而含有的赖氨酸和疏水性氨基酸较多导致其具有较强的表面活性、较好的溶解性、乳化性与稳定性[1][2]。段春红[3]等研究大豆分离蛋白亚基及7 S/11 S比例对肉肠品质的影响时发现7 S/11 S与肉肠的弹性呈现极显著的正相关性，与咀嚼性和凝胶强度均呈现显著的正相关性，但与硬度的相关性不显著，与得率呈现显著的负相关性。

20世纪50年代起至今，人们一直不断研究7 S与11 S的分离方法，这些方法主要包括碱溶酸提法、冷沉法、盐析法等，其中碱溶酸提法由于其较好的得率和提纯纯度一直被视为经典的分离方法，但近来也有学者在冷沉的基础上研究冻融处理的分离方法。

二、超速离心分离法

超速离心根据沉降系数划分大豆蛋白质组分，是一种非常直接的方法。Wo l f等人[4][5]用超速离心技术分析了大豆种子提取蛋白，计算了沉降系数S,根据超速离心的光吸收曲线峰谷变化所对应的沉降系数，把大豆蛋白质划分为4个组分，即2 S、7 S、11 S和15 S。由于11 S与7 S分子大小不同，沉降速率存在差异，采用超速离心机可以将他们从溶液中沉淀分离出来。但是，超速离心分离心法对于大规模分离纯化并不是经济高效的方法，仅仅适用于实验室对7 S或11 S组分进行分析。

三、碱溶酸提分离法

碱溶酸提法利用蛋白质组分间在不同溶液中等电点不同，通过调节p H值，使蛋白质组分逐一沉淀，从而获取相应的提取物。

（一）Thanh 分离法

T h a n h等人[6]基于7 S和11 S在P H值6.1~6.6的溶解度不同研究了一种直接分离7 S和11 S的方法。大量研究表明，11 S球蛋白在P H 6.5中是可溶的，但是在T r i s-H C l缓冲液中，当P H值6.1~6.6时，11 S表现得溶解性下降。T h a n h等人使用含有10 m M2-巯基乙醇T r i s缓冲液（P H 8.0）提取蛋白质，加入了离子强度小于0.07的N a C l，利用“盐溶”的效果增加了11 S组分的得率。在提取过程中添加还原剂如2-M E或S B S目的是稳定实验体系，保持蛋白质自然状态，破坏组分之间的二硫键从而进一步增加获取组分的纯度。调整P H值至6.4，收集沉淀,并在2~5℃离心分离大豆球蛋白，调整P H4.8，7 S沉淀，然后再溶解到0.03 MT r i s缓冲液中，调P H值至6.2，离心后，除去不溶解的聚合物后获得7 S组分。这种方法可以同时获取两种蛋白组分，但是，由于离子强度的不同，一部分7 S类似物会转变为游离态，蛋白质交叉污染始终是存在的问题。11 S分离组分纯度，如果提高组分的纯度，需要进一步处理，如凝胶过滤或层析，但会增加成本，而且难以规模化生产。

（二）Nagano 分离法

为了减少中间组分的交叉污染，获得纯度高的分离组分，N a g a n o等人[7]改进T h a n h等人的方法：1.提取液采用P H 7.5的水取代T r i s缓冲液；2.亚硫酸氢钠作为还原剂代替具有毒性的巯基乙醇；3.调整三次 P H值（P H 6.4,P H 5.0，P H 4.8）分别得到三种蛋白质组分沉淀，去除中间组分，沉淀中间产物的目的是在获取富含大豆球蛋白的成分后，将上清液中的大豆球蛋白组分尽量沉淀，以获得更高纯度的β-伴大豆球蛋白，中间组分的蛋白质得率和固体含量随着N a C l含量的增加而降低。这种方法得到的两种蛋白质粗组分的纯度大于90%。4.加入了N a C l，利用“盐析”作用，破坏蛋白质亲水层，促进7 S沉淀。这一方法大大提高了提取组分的纯度，但是7 S与11 S组分的得率大大降低。朱晓烨等[8]对N a g a n o法的条件进行了优化，浸提液p H 9.0，浸提温度选择45℃而不是室温，采用两次浸提法，添加还原剂N a H S O3的量增加为0.01 m o l/L。在分离过程中，p H 5.4时除去中间组分，优化后的方法其提取率和蛋白纯度与N a g a n o法相比得到提高。

（三）Wu 的分离方法

1999年，Wu等人[9]不仅将仅限于实验室获取蛋白组分的N a g a n o的方法进行改进，而且研究了一种适合中试规模生产的提取方法，将分离各步骤中采用的离心速度进行修改，并使用两步提取代替一步提取，从而提高了产物得率和纯度。但是，中试过程没有使用实验室操作的方法操作中的膜过滤脱盐步骤。它所获得的大豆球蛋白和中间混合组分的得率低于实验室操作的方法，这可能是由于离心机不同而在离心过程中造成了损失。11 S纯度在实验室规模和中试规模条件下分别为95.7%和84.2%，7 S分别为77.6和71.8%。

（四）Liu 等人的分离方法

基于N a g a o和T h a n h方法，L i u等人[10]优化了从提取液中分离蛋白的方法，P H调整至8.5、温度从上述方法采用的室温提升至45℃、大豆粉/T r i s-H C l缓冲液的比率以及N a H S O3的浓度均做了调整，最终获取的富含7 S和11 S组分的得率分别达到了14.4%和10.7%，与此同时，7 S纯度也超过95.5%。司晓霞等人[11]对L i u等所报道方法的关键环节进行了进一步的条件优化，将S B S的最适浓度确定为0.03 m m o l·L-1；二是在7 S析出之前，通过加水析出、离心法去除一次混杂的11 S球蛋白，这两个环节的条件优化最终使得β-伴大豆球蛋白的提取纯度达到98%。

四、冷沉法分离

大豆蛋白中7 S球蛋白的含硫氨基酸含量较低，其中β-伴大豆球蛋白的β亚基无含硫氨基酸[6],11 S球蛋白含硫氨基酸含量较高，是7 S球蛋白含硫氨基酸含量的5~6倍，每摩尔11 S球蛋白分子中至少包含20个二硫键[12]。E.J.N o h[13]等人发现冷冻处理的大豆疏水作用加强，分子内二硫键连接，不论加热与否，冷冻处理增加了大豆蛋白的疏水性。通过冷冻处理会使二硫键交联，疏水性增强，从而形成分子聚合物沉淀，在一定程度上实现11 S与其他组分如7 S的分离。Wo l f等[2]在室温下用离心的方法提取大豆水溶性蛋白，将提取的蛋白质水溶液进行冰浴、离心，获得含11 S的冷沉蛋白达到82%，这就是早期分离提取11 S组分的基本方法，称为冷沉法(c o o l i n g p r e c i p i t a t i o n)。1967年Wo l f等[4]进一步优化“冷沉法”分离提取11 S的条件，通过改进，11 S组分的含量提高至88%。

K a z u h i r o M o r i t a[14]等人研究了豆浆中的7 S和11 S球蛋白的冻融分馏机制，采用冷冻、缓冻的方式处理制备的豆浆，冷冻时，蛋白质和复合物被冰晶包围，在未冻结的部分中被浓缩，蛋白质分子通过二硫键和/或疏水相互作用进一步加强，形成主要由11 S球蛋白和11 S球蛋白-脂质复合物组成的聚合物。在解冻阶段，聚集体解冻、沉淀，7 S球蛋白由于其高亲水性可能会形成可溶性聚集体保留在上清液中。因此，大多数的11 S球蛋白迁移到下层，并且大部分的7 S球蛋白的保留在解冻豆浆的上层。并且发现每当11 S/7 S比达到或超过0.53，就形成沉淀物，即如果在豆浆中球蛋白11 S/7 S比值超过0.53，7 S和11 S球蛋白可以由冻融操作分离。

五、盐析法分离

（一）Saio等人的分离方法

蛋白质与盐离子的作用一方面可以使蛋白质在水中的溶解度增加，另一方面也可因为屏蔽了其表面电荷使其发生聚沉。S a i o法的原理是基于11 S和7 S球蛋白在钙盐溶液中溶解度存在着较大的差异而进行提取分离。脱脂大豆粉采用C a C l2溶液浸提,然后离心，取沉淀物置于40℃水中,调p H至8~8.2，搅拌2 h,再离心，沉淀物为11 S球蛋白粗提物，第一步中分离的上清液通过调P H值4.5得到沉淀物为7 S组分。但是，这种分离方法获得的11 S和7 S纯度较低（分别为40.4%和60.5%）[16]。

（二）Deak等人的分离方法

由于11 S与7 S表面电荷密度存在差异，7 S和11 S在同一种盐的作用下，发生盐析时所需盐的浓度是不同的。D e a k等人使用C a C l2作为沉淀剂，11 S组分在P H 6.4时较7 S组分优先与二价阳离子结合，这种改进后的方法显著增加了7 S和11 S组分的得率(分别为15.1和23.6%)，但是纯度比N a g a n o法低[17]。与此同时，C a2+在p H 6.4时也容易与带负电荷的植酸（P A）形成不溶性的质酸盐，从而导致植酸（P A）含量的提高[18]，并且当p H高于4.5也易形成P A-C a2+蛋白质复合物沉淀，破坏食品的营养价值，T e n g等人[19]使用M g C l2代替C a C l2降低了11 S组分的植酸含量，同时得到令人满意的得率（22%的11 S和16%的7 S）与纯度(88%的11 S和80%的7 S)。

六、结语

综上所述，碱溶酸提法作为一种经典有效的分离方法广为应用，方法也被不断改进和优化，提取的效果与提取液的温度、种类、还原剂的种类和浓度、提取组分的P H值、离子强度以及离心速度有密切的联系。冷沉法虽然研究较早但是由于提取率和纯度不及碱溶酸提法而应用较少，近来，冻融法分离也为分离方法提供了新的思路，如将可以提高提取效果的上述影响因素结合到该方法中，可能会增强冷沉法的提取效果。

[1]Tsubokura Y，Hajika M，Harada K.Molecular characterization of aβ-Conglycinin deficient soybean[J].Euphytica，2006.

[2]姜振峰等.大豆种质资源贮藏蛋白亚基研究[J].东北农业大学学报,2006(5).

[3]段春红，婉思轶.大豆分离蛋白亚基及7S/11S比例对肉肠品质的影响[J].中国粮油学报,2010(1).

[4]Wolf W J,BriggsD R.Purification and characterization of the 11S component of soybean proteins[J].Arch Bioch Biophy,1959.

[5]Wolf W J,Eldridge A C,Babcock G E.Physical properties of alcohol extracted soybean proteins[J].Cereal Chem,1963.

[6]Thanh V H,Okubo K,Shibasaki K.Major proteins of soybeanseeds a straightforward fraction and their characterization heterogeneity of Betaconglycinin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1976.

[7]NaganoT,MtohikoH,HiroyukiM,etalDynamic viscoelastic study on the gelation of7S globulin from soybeans[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992.

[8]朱晓烨等.大豆蛋白7S和11S组分分离方法的优化[J].食品工业科技,2011(7).

[9]Wu S,Murphy P A,Lawrence A.J et al Pilot-plant fractionation of soybean glycinin and βconglycinin[J].Journal of the Amer-I can Oil Chemists'Society,1999.

[10]Chun Liu,HonglingWang,Zhuimei Cu,i et a.l Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S glibulins of soybean seed storage protein[J].Food Chemistry,2007.

[11]司晓霞等.大豆中β-伴大豆球蛋白提纯方法的优化[J].植物研究,2011(4).

[12]Chandrika L P，Fereidoon S.Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surfaceme thodology[J].Food Chemistry,2005.

[13]E.J.Noh a,S.Y.Parkb,J.I.Pakc,S.T.Hongd,S.E.Yuna.Coagulation of soymilk and quality of tofu as affected by freeze treatment of soybeans[J].Food Chemistry,2005.

[14]Kazuhiro Morita,Makoto Shimoyamada.Proposal of mechanism of the freeze thaw fractionation of 7S and 11S globulins in soymilks[J].Food Chemistry,2013.

[15]Kyokok Saio,Twao Sato,Tokuji Watanabe.Food use of soybean 7S and 11S proteins High temperature expansion characteristics of gels[J].Food science,1974.

[16]王孝英等.7S和11S大豆球蛋白的分离研究[J].中国食品添加剂，2006（3）.

[17]DeakNA,MurphyPA,JohnsonLA.Effectsof reducing agent concentration on soy protein fractionation and functionality[J].Journal of Food Science,2006.

[18]GrynspanF,Cheryan M.Calcium Phytate:effct of PH and molar ratio on invitro solubility[J].Am Oil Chem Soc,1983.

[19]Zi Teng.Chong Liu.Xiao quan Yang.Lin Li.Chuan he Tang.Yue ming Jiang.Fractionation of Sogbean Globulins Using Ca2+and Mg2+:A Compara tive Anglysis[J].Am Oil Chem Soc,2009.