蛋白质组学在人乳及牛乳蛋白研究中的应用现状*

杨梅，徐鑫，张居明，乌日娜，岳喜庆

(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

“蛋白质组”是由澳大利亚学者Wilkins等于1994年提出，指的是由基因组编码的全部蛋白质［1］。根据乳蛋白质组学的研究内容，可以分为结构乳蛋白质组学和功能乳蛋白质组学。结构乳蛋白质组学主要是研究乳中蛋白质的表达模式;功能乳蛋白质组学主要是研究乳中蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用［2］。乳蛋白质组学的研究方法主要有两种:一种是“全蛋白质组学”，也就是检测乳中基因组表达的所有蛋白质;另一种是“差异蛋白质组学”，主要是筛选和鉴定不同种类或不同状态下各样本乳之间蛋白质组的区别与变化［3］。

乳中的主要成分是由乳蛋白、乳糖和乳脂构成，其中乳蛋白质是乳中最重要的组成成分。乳蛋白质可以为新儿和哺乳动物提供氮、酶、激素及免疫物质等，对其健康成长有重要的作用。乳中含有丰富的蛋白质，其中酪蛋白(CN)、乳清蛋白(WP)和乳脂球膜蛋白(MFGM)是乳蛋白的重要组成部分［4-5］。乳中有种类多样、含量丰富的蛋白质，由于遗传变异和翻译后修饰对乳蛋白的影响，使乳蛋白的组成变得复杂、庞大［6］。本文阐述了蛋白质组学在人乳与牛乳蛋白研究中的应用进展，以及乳酪蛋白质组学、乳清蛋白质组学、乳脂肪球膜蛋白质组学、乳铁蛋白质组学的研究，为寻找疾病的临床诊断和治疗、乳品加工保存条件、开发新型婴幼儿食品提供重要的理论依据。

1 乳蛋白

乳蛋白质是乳中最重要的组成成分之一，其含量和组成是决定乳质量的重要指标。乳中的蛋白质调控着婴幼儿及哺乳动物幼崽的生命活动。通过蛋白质组学的方法对乳蛋白进行研究，能够直观、整体地分析蛋白质的组成以及在生命活动中的调控规律，可以更全面深入地阐明蛋白质的表达信息。利用蛋白质组学技术可以对乳中蛋白质的含量以及组分进行鉴定，也可对乳中蛋白的糖基化、磷酸化、乙酰化等翻译后修饰进行特征性描述，蛋白质组学己成为乳蛋白表达和翻译后修饰分析的重要工具［7］。因此，研究人乳与牛乳蛋白能够为乳的功能性质、营养价值以及分泌机制提供有利的依据。

1.1 乳蛋白的遗传多态性

乳蛋白是由乳腺上皮细胞合成并分泌的营养物质，乳蛋白的基因型受位于常染色体上的等显性基因控制，属于孟德尔式遗传。1953年，Aschaffenburg等利用纸层析法对牛乳中的β-乳球蛋白进行首次分析，得到2种不同的遗传变异体，由此展开了对乳蛋白多态性研究的序幕［8］。随后，许多学者利用脲素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea-APGE)和等电聚焦电泳(IEF)等先进方法检测不同蛋白变异体在乳中的分布情况，对乳蛋白多态性方面有了深入的了解。许多学者认为，乳蛋白遗传变异是基因直接表达的产物，其多态性的类型受到显性基因控制，是基因产物直接表达的形式，并研究了乳清蛋白中2个蛋白的位点，发现了11个复等位基因［9］。目前，还没有对乳蛋白遗传多态性进行深入、系统的研究。因此，利用蛋白质组学的方法研究乳蛋白遗传多态性以及乳蛋白泌乳性能相关性，有助于对乳的遗传多样性、遗传分化的了解。

1.2 乳蛋白的翻译后修饰

人乳与牛乳中蛋白质的正常功能是由体内基因表达产物空间构象的正确形成决定的，在此过程中蛋白质的翻译后修饰发挥着重要的调节作用。由于翻译后修饰使乳蛋白质的结构变得更加复杂，调节更加精细，作用更加专一［10］。翻译后修饰存在20种以上的修饰类型，比较常见的有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化，目前对乳蛋白质翻译后修饰的研究较多的为糖基化和磷酸化。研究乳蛋白质翻译后修饰对了解乳蛋白的结构和功能具有重要的意义。Holland等［11］采用2-DE与β-消除结合的方法从牛乳中分离出了κ-酪蛋白，并利用质谱技术鉴定出5个潜在的O-糖基化位点存在于 κ-酪蛋白中。Froehlich等［12］利用蛋白组学的方法对人乳中糖蛋白的表达情况进行研究，结果表明，乳铁蛋白的糖基化程度在泌乳期的前期呈动态变化，并且在一些乳清蛋白中也存在糖基化程度变化。Miclo等［13］利用2-DE技术分离了低分子质量β-酪蛋白，并结合LC-ESI-MS技术鉴定出β-酪蛋白是由于磷酸化修饰从而形成了存在17个磷酸基团的低分子质量的磷酸化β-酪蛋白。对乳蛋白质翻译后修饰的深入研究，有利于预防和治疗由其引起的疾病，以及为乳的功能性质以及营养价值提供有利的依据。

1.3 乳高丰度蛋白分析

乳中的高丰度蛋白主要是由酪蛋白以及乳清蛋白构成，利用蛋白质组学的方法对乳中高丰度蛋白的分析相对较为简单。Aslam等［14］利用2-DE技术对奶牛哺乳期乳蛋白的表达模式进行了分析，发现随着哺乳期的延长酪蛋白含量有所降低。Ferranti等［15］采用高效液相色谱(HPLC)的方法将CN进行分离，得到了4个主要的峰，经电喷雾质谱(ESI-MS)鉴定，每个峰只含有1个酪蛋白家族，它们分别是αs1-CN、αs2-CN、β-CN 和 κ-CN。Miranda等［16］利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对脱脂乳蛋白中的CN进行分离，经由Edman微序列和质谱鉴定，发现了αs1-CN和β-CN存在多态性。对乳蛋白中的主要成分的鉴定，有利于更深入的了解物种间、品种间乳蛋白的差异，为乳产品提供更多的有利信息。

1.4 乳低丰度蛋白分析

乳蛋白中含有一部分含量很少却可以作为调控蛋白、受体和酶等具有生物学特定功能的蛋白质，也就是低丰度蛋白。利用蛋白质组学的方法对乳低丰度蛋白进行分析时，需要移除高丰度蛋白，或者相对富集低丰度蛋白，是对乳低丰度蛋白研究的主要方法。Yamada等［17］通过免疫吸附的方法除去β-CN以及免疫球蛋白后，研究了奶牛初乳和常乳中低丰度差异蛋白质，发现奶牛初乳中含有特异的蛋白质。Holland等［18］利用半胱氨酸标签法移除了αs1-CN和β-CN这2种酪蛋白后，对乳清中其他类型酪蛋白异构体进行了分析。Panchaud等［19］利用阴离子交换和分子过滤作用的方法富集了人乳中的低丰度蛋白，接着通过SCX/RP进行分离，利用质谱技术鉴定出乳清中43种蛋白质。在对人初乳的研究中，通过免疫吸附去除高丰度蛋白质后，鉴定出151个乳清蛋白质，其中有83种是从前没有发现的［20］。因此，乳中低丰度蛋白的检测对全面认识乳蛋白有重要意义。

1.5 乳蛋白质水解分析

乳蛋白质的水解主要为酶水解、化学水解和物理水解等。乳蛋白质经水解后获得的多肽具有易于吸收利用，抗高血压，促进钙、磷吸收，抗血栓等特定功能。因此，乳蛋白水解后获得的小分子肽具有比蛋白质更高的营养价值和生物活性。Kunji等［21］将蛋白质水解系统中存在编码关键酶的几个基因切除后，分析了L.lactis中β-酪蛋白的水解途径，实验结果表明细胞壁上存在具有底物特异性的蛋白酶，并且在β-酪蛋白的C-末端表现。Rival等［22-23］利用蛋白质组学技术发现利用胰蛋白酶将β-酪蛋白酶解后多肽的抗氧化活性最强，将酶解后的多肽进行分离纯化，获得了3个具有较强抗氧化活性的多肽段，并证实了β-酪蛋白酶解物具有抑制过氧化反应的功能。Deutsch 等［24］对 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbruecki subsp.lactis和 Streptococcus thermophilus几种嗜热乳酸菌提取物的水解作用进行了分析，其中L.helveticus对β-酪蛋白的水解能力最强，但水解产物中的磷酸肽几乎是不能被降解的。因此，研究乳蛋白质水解多肽有利于提高乳蛋白的利用价值，并为开发新的功能性食品提供依据。

2 乳蛋白质组学

2.1 乳酪蛋白质组学

乳酪蛋白是由乳腺上皮细胞合成的磷蛋白，含有大量的磷和钙以及几乎全部的必需氨基酸，是对新生儿及幼崽最具营养价值的蛋白质，可以对钙和磷的吸收具有促进作用。CN通过新生儿或幼崽胃肠道蛋白酶作用后，释放出的生物活性肽对新生儿或幼崽的消化、吸收和免疫具有调节作用。因此，利用蛋白质组学的方法研究乳酪蛋白对了解乳蛋白对新生儿及幼崽的生命活动有重要作用。Ciavardelli等［25］采用电感耦合等离子体质谱法的方法对牛乳中α-CN和β-CN磷酸化位点进行了鉴定，使CN的磷酸化蛋白质组学成为乳酪蛋白组学研究的重点。Poth等［26］采用2-DE结合MALDI-TOF-MS的方法分离并鉴定了人乳蛋白，对磷酸化程度进行了分析，得到了6个磷酸化β-CN点。Girardet［27］等采用RP-HPLC分离技术得到了β-CN，并结合ESI-MS/MS鉴定出β-CN具有不同的磷酸化形式。Brophy等［28］采用IPG技术分析了正常牛乳和转基因牛乳中的β-酪蛋白和κ-酪蛋白，并进行了定量比较，结果表明转基因牛乳中的酪蛋白比正常牛乳含量更高。Claverol［29］等采用了2-DE结合MS技术的方法对κ-酪蛋白的混合物进行研究，并揭示了将不同的磷酸化和糖基化模式分离成的异构体的方法。一些其他学者利用2-DE结合质谱的方法对乳中的αs1-酪蛋白异构体进行了研究［30］。以及利用2-DE的方法分析了酪蛋白亚型模式［31］。利用2-DE的方法对水牛乳酪蛋白和牛乳酪蛋白进行差异蛋白分析，通过电泳图谱对比，发现了14个差异点，而在水牛乳酪蛋白与山羊乳酪蛋白的电泳图谱中发现了10个差异蛋白点，利用质谱进行鉴定，得到了4个存在于水牛乳酪蛋白的主要组分，为在不同乳源蛋白中发现未知蛋白提供依据［32］。

2.2 乳清蛋白质组学

乳清蛋白是乳去除CN后，分离出来的乳清中所含有的蛋白质。乳清蛋白中存在较多对机体具有调控和免疫作用的免疫球蛋白。近年来，通过蛋白质组学研究发现，机体防御蛋白质作为含量最大的蛋白质种类存在于乳清蛋白中，机体防御蛋白质包括含量较高的免疫球蛋白以及含量较低的补体系统蛋白等［33］。随着蛋白质组学技术的快速发展，乳清蛋白作为研究乳房炎的关键，通过对比患乳房炎及健康乳房分泌蛋白在种类及组成上的差异，找出能够预测隐型乳房炎的生物标记物，因此乳清蛋白质组学已经成为预测乳房炎的关键。Boehmer等［34］通过蛋白质组学的方法对受大肠杆菌侵染的乳房与侵染不同时间分泌的乳清蛋白质的组成及含量进行了差异分析，实验结果表明抗菌肽-1蛋白和肽聚糖识别蛋白受体蛋白的含量随着侵染时间及体细胞数的增加而增加。将牛乳乳清蛋白通过热处理变性后，利用蛋白质组学技术鉴定出β-乳球蛋白经过水解能够产生2种多肽，因此β-乳球蛋白能够作为定量分析乳及乳制品中未降解乳清蛋白含量的目标蛋白［35］。Murakami等［36］采用2-DE的方法对乳清中的蛋白质组分进行了分离，并且对蛋白质的斑点进行鉴定，实验结果表明在51ku处的蛋白质斑点为凝聚素α-链。因此，利用蛋白质组学技术研究乳清蛋白有利于对疾病的预防与治疗。

2.3 乳脂肪球膜蛋白组学

近年来，乳脂球膜(MFGM)蛋白作为乳蛋白的一个特异性亚类受到许多学者的关注。乳脂肪球膜蛋白质包含来自于内质网、细胞膜及细胞质中的蛋白质，可以部分代表泌乳细胞中的蛋白质［37-38］。Charlwood等［39］采用2-DE分离技术结合 MALDI-TOF鉴定的方法，研究了人乳脂球膜蛋白中凝聚素、乳转铁蛋白、多聚免疫球蛋白受体和lactadherin 4个主要蛋白质，发现这4种蛋白的糖基序范围差异较大。Goldfarb等［40］采用2-DE的方法对人乳脂球膜蛋白进行了分离与鉴定，发现阿朴脂蛋白E存在4种分子质量的异构体。Quaranta等［41］提出了一个新的人乳脂肪球膜蛋白的提取方案，然后运用2-DE进行分离，并获得了23个蛋白质斑点，经过序列分析，发现1种新蛋白质的存在。乳脂球膜中的蛋白质具有重要的生物学活性，这些蛋白质大部分是未知的。因此，对乳脂球膜蛋白质进行蛋白质组学的研究有极其重要的意义。

2.4 乳铁蛋白质组学

乳铁蛋白(lactoferrin，简称LF)又称乳转铁蛋白，在哺乳动物的乳汁中含量非常丰富。近些年来，随着蛋白质组学技术的不断发展，许多国家开始意识到乳铁蛋白的使用价值，因此利用蛋白质组学的技术研究乳铁蛋白有助于其在食品、医药等领域的应用。Silvia Catinella等人［42］利用 MALDI-TOF/MS 技术研究了脱脂后的人初乳、人常乳蛋白质的质谱图，发现随着泌乳期的延长，乳铁蛋白的重链呈递减趋势。石磊等［43］利用FT-ICR/MS技术对经过脱脂的人乳乳脂、乳清和乳粒中的蛋白成分进行了分析和鉴定，并在乳清和乳粒中获得了乳铁蛋白。王静等人［44］利用蛋白质组学技术对母乳进行了分析，通过SDS-PAGE检验免疫前后母乳中高丰度蛋白的质量分数，得到了乳铁蛋白的清晰条带。David J Palmer等人［45］在研究脱脂人初乳中的低丰度蛋白时，利用SDS-PAGE检测脱除高丰度蛋白的效果，通过初乳电泳图谱分析，观察到了乳铁蛋白。Boesman-Finkelstein等人［46］利用SDS-PAGE分离技术对脱脂脱酪蛋白的人乳乳清液进行了分析，获得了乳铁蛋白条带。Manso.等［47］利用毛细管区带电泳 (CZE)的方法对人乳与牛乳进行了差异蛋白的比较研究，并分析了不同泌乳阶段下脱脂人乳中主要蛋白的电泳图谱，同时以UHT(超高温瞬时灭菌)牛乳做为对照，结果在3周时的人乳中出现了乳铁蛋白的峰形，而这个峰形牛乳则没有。

3 展望

蛋白质组学作为乳蛋白质研究的主要策略之一，虽然刚刚起步，却能够在蛋白质水平上揭示生命现象的本质及活性规律。随着蛋白质分离和鉴定技术的不断发展，以及乳蛋白质组图谱和数据库的不断完善，应用蛋白质组学技术对人乳、牛乳蛋白质组进行全面、深入的研究，为寻找疾病的临床诊断和治疗、乳品加工保存条件、开发新型婴幼儿食品提供重要的理论依据。但是，由于蛋白质组学技术以及乳蛋白的复杂性，乳蛋白质组的研究还存在一些问题，对乳中的低丰度蛋白的全方位的鉴定、比较还不是很成熟。乳蛋白的合成与降解、翻译后修饰的表达分析是乳蛋白质组学的核心问题，还具有一定的发展和研究空间。

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